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NgR1拮抗剂对脑梗死后轴突损伤的保护作用
目的 应用Nogo-66受体拮抗剂(sNgR1-Fc)对脑梗死大鼠进行治疗,观察其对梗死灶区域细胞轴突的保护及再生作用,并探讨其发挥作用的机制.方法 取SD大鼠15只,光化学法建立大脑皮层局灶缺血梗死(PCI)模型.设假手术组、PBS组和sNgR1-Fc治疗组,PBS组于侧脑室内注射PBS,sNgR1-Fc组则注射sNgR1-Fc.在PCI术后7d,利用电镜观察各组梗死灶区域神经细胞轴突的形态学变化；Western blot技术检测梗死区细胞中RhoA,JNK及其下游的c-JUN、ATF-2蛋白的表达情况.结果 光化学法可以成功复制大脑皮层局灶缺血梗死模型.电镜下,在PCI后7d,与假手术组比较,脑梗死组可见到严重的病变,无鞘纤维方面可见广泛的轴浆水肿或溶解、基质变淡；有鞘纤维方面可见广泛的髓鞘增厚或皱缩、板层紊乱,应用sNgR1-Fc处理后,上述现象均有明显改善.Western blot实验表明,在PBS组中,GTP-RhoA、p-JNK1、p-JNK2、p-c-JUN及p-ATF-2在较假手术组显著升高(P＜0.05),sNgR1-Fc处理后各因子的表达水平显著下降(P＜0.05),而Total-RhoA及Total-JNK1、Total-JNK2水平差异无统计学意义(P＞0.05).结论 脑梗死发生后在较长的一段时间内都存在着显著的轴突损伤,这可能与激活RhoA/ROCK/JNK/c-Jun信号通路有关,并导致了轴突的再生受抑.而sNgR1-Fc则能有效地抑制这一通路,从而在一定程度上减轻轴突的损伤,并可能对促进轴突的再生发挥一定的作用.
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拮抗髓鞘抑制蛋白促进神经前体细胞分化的机制
目的 建立局灶性缺血性脑梗死模型,观察Nogo-66受体(NgR1)拮抗剂(sNgR1-Fc)促进内源性成体神经前体细胞(NPCs)定向分化的作用,并探讨其机制.方法 取SD大鼠12只,光化学法建立大脑皮层局灶缺血梗死(PCI)模型.设假手术组、PBS组和sNgR1-Fc治疗组.在PCI术后第1～3天,通过小型渗透性微泵持续性地向梗死灶同侧的侧脑室灌注sNgR1-Fc或同等体积的PBS;第4～6天,通过腹腔注射BrdU(bromodeoxyuridine)；在PCI术后35 d,利用免疫组化染色观察各组海马齿状回NeuN+/BrdU+细胞的比率；Western blot检测梗死侧海马Notch1、Mash1及Neuro D蛋白的表达情况.结果 光化学法可以成功地建立局灶性缺血性脑梗死模型.PCI术后35 d时梗死灶同侧的海马齿状回,sNgR1-Fc处理组的BrdU+细胞的数目显著高于PBS组(P＜0.01),NeuN+/BrdU+细胞的比率也显著高于PBS组(P＜0.05).Western blot实验表明,sNgR1-Fc治疗组海马的Notch1、Mash1、Neuro D蛋白的表达显著高于PBS组,后者又显著高于假手术组.结论 NgR1拮抗剂NgR1-Fc能够促进脑梗死后大脑中的神经前体细胞向神经元方向分化,这一作用可能是通过影响Notch和bHLH家族信号通路而发挥的.
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nogo基因及其相关蛋白与中枢神经再生的研究进展
哺乳动物体内大部分组织如肌肉、皮肤、肝脏和外周神经损伤后均有很强的再生能力,而大脑和脊髓组成的中枢神经系统(CNS)却很难再生,损伤后的轴突及神经元几乎不能再生,导致损伤后功能迟迟不能恢复.CNS缺乏自我再生和修复能力一直是神经科学界的难点和热点.
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化学合成小干扰RNA对PC12细胞N gR表达的影响
目的： Nogo及Nogo-66受体（NgR）对抑制中枢神经系统再生有重要的作用。本文主要观察化学合成NgR特异性小干扰RNA（siRNA）对具有神经元分化潜能的克隆细胞系PC12细胞 NgR mRNA 和蛋白表达的影响。方法培养大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞 PC12细胞，神经生长因子（NGF）诱导使其分化为类神经细胞，化学合成一段针对大鼠NgR基因编码区的siRNA，用阳离子脂质体使之转染类神经细胞，转染后48 h，采用实时荧光定量PCR检测mRNA水平；并采用蛋白免疫印迹检测NgR蛋白表达的变化，检测干扰的效果。结果荧光定量PCR结果显示：转染后48 h NgR mRNA水平明显下降，差异具有显著性（P＜0.05）；同时蛋白免疫印迹结果显示，NgR蛋白表达水平与对照组比较也降低，差异同样具有显著性（P＜0.05）。结论化学合成NgR特异性siRNA可以实现大鼠神经细胞内源性NgR基因沉默。
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大鼠脊髓来源神经干细胞NgR的表达
目的:检测大鼠脊髓来源神经干细胞Nogo-66受体(NgR)是否表达.方法:悬浮培养法培养大鼠脊髓来源的神经干细胞,形成神经球后,以免疫荧光法鉴定神经干细胞并检测NgR的表达情况.结果:神经球及单个神经干细胞均显著表达NgR.结论:NgR在脊髓神经发育的干细胞阶段即开始表达.
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Nogo-66受体分子在体外培养的星形胶质细胞中的表达
目的检测Nogo-66受体(NgR)在体外培养的大鼠星形胶质细胞中的表达.方法利用RT-PCR、West-ern Blot和间接免疫荧光染色技术,检测原代培养并纯化的星形胶质细胞中NgR mRNA和蛋白分子的表达.结果利用RT-PCR技术,从星形胶质细胞总RNA中扩增出特异的NgR条带;利用Western Blot技术,从星形胶质细胞抽提物中检测到64kD特异性的NgR反应条带;间接免疫荧光染色和Confocal显微镜进一步显示,星形胶质细胞中的NgR免疫反应物主要位于细胞内.同时,来源于大鼠的C6胶质瘤细胞也证明表达NgR蛋白.结论体外培养的星形胶质细胞中表达NgR分子,这为证明NgR在体内胶质细胞中的表达提供了更直接的证据.
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大鼠弥漫性轴索损伤对脑内NgR表达的影响
目的:研究大鼠弥漫性轴索损伤(DAI)对脑内Nogo-66受体(NgR)表达的影响.方法:采用Marmarou设计的重物撞击法致伤.免疫组化检测NgR蛋白表达的变化,原位杂交检测脑内NgR mRNA表达的变化.结果:脑内NgR蛋白和NgR mRNA的表达水平在DAI后明显下降,在伤后72小时降到低,此后逐渐恢复,到第7天基本恢复伤前水平.结论:DAI后大鼠脑内NgR的表达呈短期下降.
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Nogo－66受体与髓鞘相关抑制因子在LPS诱导宫内感染所致早产鼠脑白质损伤中的表达
目的：探讨脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）诱导宫内感染后Nogo－66受体（Nogo－66 receptor，NgR）、髓鞘相关抑制因子（myelin associated inhibitory factors ，MAIFs）———Nogo－A、MAG和OMgp mRNA及活化RhoA蛋白在早产鼠脑白质组织中的变化。方法：应用LPS和RU486诱导分别建立宫内感染所致早产鼠模型和单纯早产鼠模型，各组随机选取40只，雌雄不拘，即WMD组和对照组。实时荧光定量PCR检测P1（1日龄）、P3、P5和P7早产鼠脑白质MAIFs（ Nogo－A、MAG、OMgp）和NgR mR－NA，Western Blot检测脑组织活化RhoA蛋白，HE染色观察脑组织病理学改变。结果：与对照组相比，WMD组Nogo－A、 MAG、OMgp和NgR mRNA在P1、P3、P5、P7均明显增高（P＜0．05）；活化RhoA蛋白水平在相应的时间点也明显增高（P＜0．05），P5增高更显著，且与NgR、Nogo－A、MAG和OMgp mRNA的表达均呈正相关（r＝0．8026、0．7584、0．6565、0．7778，P＜0．05）。结论：LPS诱导宫内感染所致早产鼠脑WMD，可能通过上调MAIFs 和共同受体NgR的表达，激活相应靶细胞内RhoA信号通路参与WMD的发病机制。
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NgR受体复合体介导中枢神经再生抑制机制研究
如何促进受损神经再生,尽可能地恢复神经功能,是世界神经科学者面临的一大难题.本文从中枢神经髓鞘相关抑制分子,抑制分子受体(Nogo receptor,NgR),细胞内信号传导路径等环节,阐述抑制分子引起神经再生失败的分子机制.
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Nogo-66受体在脂质筏中的定位
目的探讨Nogo-66受体(NgR)在神经元胞膜脂质筏中的定位.方法利用免疫荧光双标法检测NgR和脂质筏特异标志物穴蛋白(Caveolin)在培养的小脑颗粒神经元上的表达,并用Western blot法检测以去垢剂法提取的脂质筏中NgR的表达.结果免疫荧光双标显示NgR和Caveolin有共同的表达部位,Western blot分析发现脂质筏中NgR的表达为阳性.结论在小脑颗粒神经元胞膜脂质筏中有NgR的表达,提示脂质筏有可能促进NgR的信号转导.
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沉默Nogo-66受体的表达对宫内感染所致早产大鼠脑损伤的神经保护作用
目的：探讨特异性siRNA沉默Nogo-66受体（NgR）对宫内感染所致早产大鼠脑损伤修复的影响及作用机制。方法孕15 d Sprague-Dawley大鼠分别应用RU486和LPS诱导早产，随机选取RU486诱导的早产大鼠为对照组，将LPS诱导的宫内感染致脑损伤早产大鼠随机分为模型组、空载体组和NgR-siRNA组，每组36只。对照组和模型组仅给予常规饲养，空载体组和NgR-siRNA组均于出生后第1天（P1）经侧脑室1次性注入慢病毒空载体和NgR-siRNA慢病毒载体后常规饲养。各组分别于P3、P7、P14时随机选取8只早产大鼠断头取脑。RT-PCR检测NgR mRNA表达，Westernblot测定活性RhoA蛋白表达，免疫荧光组化检测小胶质细胞活化程度和少突胶质前体细胞（OPCs）形态，苏木精-伊红染色观察脑组织病理学改变，P30时行动物行为学评分。结果P3时，NgR-siRNA组脑组织NgR mRNA表达量、活性RhoA蛋白水平显著低于模型组和空载体组（P<0.05）；各组NgR mRNA表达量与活性RhoA蛋白水平均呈正相关性（分别r=0.792、0.747、0.827、0.825， P<0.05）。免疫荧光组化结果显示，NgR-siRNA组P3时小胶质细胞CD11b荧光强度值较模型组和空载体组明显减弱（P<0.05）；各组O4抗体标记的OPCs细胞形态主要呈现三极突起形态。病理学结果显示，对照组脑室周围白质结构正常，染色清晰；模型组和空载体组白质结构疏松，纤维紊乱，可见软化灶；NgR-siRNA组白质结构疏松，纤维紊乱相对较轻，胶质细胞增生不明显，无明显软化灶。行为学评分显示，NgR-siRNA组的悬吊实验评分、活动总路程、平均速度和跨格次数大于模型组和空载体组，而斜坡实验时间及中心区活动时间和路程明显少于模型组和空载体组（P<0.05），但同对照组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。结论 NgR特异性siRNA可有效沉默宫内感染所致脑损伤早产大鼠NgR基因表达，在脑损伤后的修复中具有显著神经保护作用。
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神经干细胞分化过程中NgR表达的变化
目的 检测大鼠脊髓来源神经干细胞分化过程中NgR的表达情况.方法 悬浮培养法培养大鼠脊髓来源的神经干细胞,形成神经球后,以免疫荧光法鉴定神经干细胞,检测神经球及其分化后不同时间点、不同细胞亚型的NgR表达情况.结果 神经干细胞分化前和分化第1天所有细胞都显著表达NgR,NgR表达阳性率在分化第2天降至82.1%±4.14%,分化第3天降至低点35.3%±4.31%.分化后形成的细胞中只有神经元和少量未分化细胞表达NgR,星形胶质细胞和少突胶质细胞不表达NgR.结论 在神经干细胞分化成星形胶质细胞和少突胶质细胞的过程中NgR基因表达被关闭,而在其分化成神经元的过程中则始终表达NgR.
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以NgR为靶点治疗脊髓损伤的研究进展
NgR是近发现并克隆的一种糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定膜蛋白,因其在髓磷脂抑制轴突再生信号转导过程中特殊的靶分子效应,日益受到重视.以NgR为靶点促进脊髓轴突再生的尝试为中枢神经系统(CNS)损伤的治疗提供了有益的启示.
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Nogo-66受体RNA干扰质粒的构建及其干扰效率鉴定
目的 构建及筛选高效率针对Nogo-66受体(Nogo-66 receptor, NgR) 进行RNA干扰(RNAi)的质粒.方法 RT-PCR克隆NgR,插入表达质粒中,构建NgR-GFP融合蛋白表达质粒.根据NgR序列,设计4对针对NgR mRNA进行RNAi的寡核苷酸.退火后,插入短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)表达质粒中,构建shRNA表达质粒.将NgR-GFP融合蛋白表达质粒与shRNA表达质粒共转染AAV-293细胞.通过对GFP表达量的观察及Western blotting定量检测NgR-GFP融合蛋白表达量,鉴定shRNA表达质粒对NgR的干扰效率.结果 针对NgR进行RNAi的4个序列中,有1个序列的干扰效率大于90%以上.结论 成功构建了1个针对NgR的高效RNAi表达质粒.
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RNA干扰沉默神经干细胞Nogo-66受体基因阻断Nogo-66抑制神经突生长作用的研究
目的 检测Nogo-66是否对大鼠脊髓来源神经干细胞分化形成的神经元具有神经突生长抑制作用,以及其抑制作用是否可以通过沉默Nogo-66受体(Nogo-66 receptor,NgR)基因的方法进行阻断.方法 体外培养大鼠脊髓来源神经干细胞,经小分子干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)转染以沉默NgR基因表达,用免疫荧光法和Western blot检测神经干细胞在转染前后NgR基因的表达.取神经干细胞分为四组,均在含10%胎牛血清的培养基中分化.对照组不加干预因素;Nogo-P4组在分化过程中加入Nogo-66的活性片段Nogo-P4;siRNA组神经干细胞经siRNA转染使NgR基因表达沉默后开始分化;siRNA加Nogo-P4组神经干细胞经siRNA转染后在含有10%胎牛血清和Nogo-P4的培养基中分化.免疫荧光法标记分化形成的神经元,测量神经突长度,比较各组神经突长度的变化.结果 悬浮培养的细胞形成典型的神经球,经免疫荧光检测Nestin表达阳性.加入10%胎牛血清分化1周后,可观察到神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白质和髓鞘碱性蛋白标记阳性的细胞.siRNA转染后24 h,大部分神经干细胞NgR基因染色转为阴性,Western blot检测神经干细胞NgR基因表达显著降低,NgR基因阻断效率为90.35%±3.10%.神经干细胞分化第3天形成的神经元神经突长度在对照组为97.80±6.97 μm,Nogo-P4组为80.54±6.75 μm,siRNA组为92.14±7.27 μm,siRNA加Nogo-P4组为94.01±8.37 μm.Nogo-P4组与其他各组比较差异有统计学意义(P＜0.01),对照组、siRNA组和siRNA加Nogo-P4组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 Nogo-66对神经干细胞分化形成的神经元有神经突生长抑制作用,可以通过RNA干扰技术使神经干细胞NgR基因表达沉默,并阻断Nogo-66抑制神经突生长的作用.
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针对Nogo-66受体分子不同抗体的反应性比较
目的: 比较几种不同的针对Nogo-66受体的抗体的反应性.方法: 利用Western blot技术, 用不同的NgR的抗体检测转染Flag-NgR或Flag-NgR H1/H2的COS细胞, 以验证NgR抗体的反应性和特异性; 利用间接免疫荧光染色技术, 检测不同的NgR的抗体对转染细胞以及颗粒神经元表达的NgR蛋白的反应性.结果: Western blot结果显示, AB5615、 sc-25659和NgRpAb都可特异识别NgR, 并且不和同源家族分子NgR H1/H2产生交叉反应; 转染Flag-NgR细胞的免疫荧光双标结果显示5种NgR的抗体均能与NgR产生特异反应, 其中仅Ngr11-A使核周NgR染色, 其余抗体可使胞膜和胞质均着色; CGN细胞荧光染色结果显示, 除Ngr11-A未观察到细胞染色外, 其余抗体均可使细胞的胞膜和突起特异着色, sc-16708和NgRpAb亦可使胞质着色.结论: 针对Nogo-66受体的这几种抗体都可以与NgR产生特异性反应; 不同NgR的抗体在Western blot和免疫荧光染色上的表现模式存在一定的差异.
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Nogo-66受体在神经元生长锥中的表达
为探讨Nogo-66受体在神经元生长锥中的定位及机能意义,本研究采用免疫荧光染色法,激光共聚焦显微镜下观察在原代培养小脑颗粒细胞生长锥的表达及其定位特征.结果发现,Nogo-66受体密集分布在细胞质和胞膜、神经突起内,延伸至生长锥体部C区和P区内,P区密度更高.Nogo-66受体定位于神经元生长锥中,提示Nogo-66受体可能参与轴突延伸和寻路的活动.
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Nogo-66受体LRR功能区的真核分泌表达
目的: 构建含有人Nogo-66受体LRR功能区段cDNA序列的真核分泌型表达载体,并在COS-7细胞中表达. 方法: 采用定向克隆的策略,在保证阅读框正确的前提下,从原核表达载体pES-His/LRR上切下编码LRR的DNA片段,亚克隆入真核分泌型表达载体pSectag2B中,构建LRR与c-Myc表位、6His标签基因相融合的真核表达质粒pSectag2B/LRR,在Lipofectamine 2000介导下瞬时转染COS-7细胞. 结果: 利用针对c-Myc表位和6His标签的抗体分别作免疫荧光和Westernblot,证实胞内表达正确融合的目的蛋白;同时双抗体夹心ELISA也检测到转染细胞上清中存在融合蛋白. 结论: 真核表达质粒构建成功,转染后目的蛋白在COS-7细胞中实现分泌表达.
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Nogo-66受体在成年大鼠脊髓白质内胶质细胞的分布
目的: 研究Nogo-66受体(NgR)在成年大鼠脊髓白质的分布情况. 方法: 选用正常雄性SD大鼠脊髓切片,进行免疫组织化学、免疫荧光双标和包埋前免疫电镜染色,观察NgR免疫阳性物质在脊髓白质的定位情况. 结果: 在光镜水平可观察到NgR阳性的点状结构主要分布在脊髓白质胶质细胞胞体周边和突起上,且与细胞膜关系密切;在电镜水平可观察到NgR阳性的胶体金颗粒分布在星形胶质细胞之间,寡突胶质细胞之间以及星形胶质细胞和寡突胶质细胞之间的缝隙连接上. 结论: 本研究提供了NgR在正常成年大鼠脊髓白质胶质细胞分布并且在缝隙连接定位的形态学证据,提示NgR可能在胶质细胞间的通讯中发挥一定的调节功能.
