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HCV非结构蛋白NS5A人源单链可变区抗体基因的筛选与鉴定
目的筛选、鉴定抗丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A的人源单链可变区抗体(ScFv)的编码基因,为HCV NS5A蛋白质生物学功能的研究及抗HCV的基因治疗研究开辟新途径.方法采用噬菌体表面展示技术,以重组纯化的HCV非结构蛋白NS5A为固相抗原,从噬菌体单链可变区抗体半合成库中经过5轮"吸附-洗脱-扩增”筛选过程,获得抗原结合活性和特异性较强的HCV NS5A人源单链可变区抗体基因片段的阳性克隆,并对其进行免疫检测及序列测定.结果筛选得到的ScFv片段基因核苷酸序列为789 nt,编码由262个氨基酸残基组成的多肽,具有典型的免疫球蛋白轻链和重链可变区的结构特点.基因编码产物具有HCV NS5A蛋白反应的免疫学活性和特异性.结论利用噬菌体抗体库技术,成功获得了HCV NS5A人单链可变区抗体ScFv编码基因,并获得了可溶性单链抗体的表达.
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全人源肝癌噬菌体单链抗体库的鉴定及筛选
目的:对全人源肝癌噬菌体单链抗体库进行鉴定,筛选肝癌抗体,同时对抗体的活性进行鉴定.方法:PCR鉴定阳性重组菌TG1中人肝癌ScFv的插入率.先以人成纤维细胞黏附后再以肝癌细胞SMMC-7721为抗原对所建抗体库进行3轮"黏附-洗脱-扩增"的亲和筛选.将筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定;通过ELISA法鉴定其与人肝癌细胞的结合活性.结果:ScFv基因插入率为70%.在亲和筛选过程中,肝癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮得到提高,第3轮为第1轮的214倍.筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定后,均可检测到目的基因.得到3株特异性肝癌单链抗体.结论:利用噬菌体抗体库技术结合减数筛选得到了肝癌噬菌体单链抗体及其基因,且筛选后的抗体片段与人肝癌细胞有特异性的结合活性.
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丙型肝炎病毒包膜蛋白E2人源单链可变区抗体的筛选与鉴定
采用噬菌体表面展示技术,以重组的HCV结构蛋白E2为固相包被抗原,从半合成的噬菌体单链可变区抗体库中经过3轮"吸附-洗脱-扩增"筛选过程,获得抗原特异性和结合活性较强的HCV E2人源单链可变区抗体(ScFv)片段,片段为771bp,阳性克隆,对其进行免疫学检测,并对HCV E2特异性ScFv的编码基因序列进行测定分析.结果筛选得到的HCV E2 ScFv片段(771bp)具有结合HCVE2抗原的生物学活性和特异性.
关键词： 噬菌体表面展示技术 丙型肝炎病毒 包膜蛋白E2 亲和筛选 噬菌体单链可变区抗体 -
乙肝病毒核心抗原人源单链可变区抗体的筛选
目的筛选、鉴定乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)蛋白的人源单链可变区抗体(ScFv)的编码基因,为细胞内表达小分子单链抗体的研究及抗HBV的基因治疗研究奠定基础.方法采用噬菌体表面展示技术,以HBcAg蛋白为固相抗原,从噬菌体单链可变区抗体半合成库中经过5轮"吸附-洗脱-扩增"筛选过程,获得抗原结合活性较强的HBcAg人源单链可变区抗体阳性克隆,并对其进行免疫检测及序列测定.结果筛选得到的ScFv片段编码基因为771nt,编码的产物由257个氨基酸残基组成,具有典型的轻链和重链可变区结构特点以及与HBcAg结合的特异性.结论利用噬菌体抗体库技术成功地获得了HBcAg人源单链可变区抗体的编码基因,并获得了可溶性单链抗体的表达.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白3人源单链抗体的筛选与鉴定
目的 筛选、鉴定抗丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白(NS)3的人单链抗体(ScFv),以解决鼠单抗的免疫原性问题,为HCV的基因治疗研究开辟新途径.方法 采用噬菌体表面展示技术,以重组的HCV NS3为包被抗原,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮"吸附一洗脱一扩增"筛选过程,获得抗原结合活性较强的HCV NS3人单链抗体(ScFv片段)阳性克隆,并对其进行免疫及序列测定.结果 筛选出来的ScFv片段具有抗NS3的特异性.结论 利用噬菌体抗体库技术,成功获得HCV NS3人单链抗体ScFv片段.
关键词： 噬菌体展示技术 丙型肝炎病毒非结构蛋白3 亲和筛选 单链噬菌体抗体 -
前列腺特异性膜抗原人源Fab抗体可变区基因的筛选与鉴定
目的:筛选、鉴定抗中国人前列腺特异性膜抗原(PSMA)的人源Fab抗体可变区的编码基因,为PSMA蛋白质生物学功能的研究及前列腺癌的基因治疗研究开辟新途径. 方法: 采用噬菌体表面展示技术,以PSMA原核表达重组子pET30a(+)-PSMA诱导表达并纯化后的PSMA为固相抗原,从噬菌体Fab可变区抗体库中经过 5轮"吸附-洗脱-扩增"筛选过程,获得抗原结合活性和特异性较强的PSMA人源Fab可变区抗体基因片段的阳性克隆,并对其进行免疫检测及序列测定. 结果: 筛选得到Fab抗体克隆的Fd段基因核苷酸序列为696 bp,编码由 232个氨基酸残基组成的多肽 ,与人免疫球蛋白γ链恒定区的同源性为98%;轻链κ基因核苷酸序列为630 bp,编码由 210个氨基酸残基组成的多肽,与κ链恒定区同源性为93%. 结论: 利用噬菌体抗体库技术,成功获得了PSMA人Fab抗体可变区编码基因克隆,该克隆抗体基因具有典型的免疫球蛋白轻链和重链可变区的结构特点,基因编码产物具有与PSMA反应的免疫学活性和特异性.
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应用噬菌体展示技术筛选缺氧诱导因子-1α相关肽
目的:应用噬菌体展示12肽库筛选低氧诱导因子-1α(HIF-1α)相关肽.方法:以抗HIF-1α单克隆抗体(HIF-1αmAb)为配基,采用亲和免疫法从随机12肽库中筛选与抗体特异结合的噬菌体.在筛选过程中,逐轮提高HIF-1α mAb的稀释度并增强洗脱强度.3轮筛选后,随机挑取10个克隆测序.通过膜斑点印迹(Dot-ELISA)进行特异性结合鉴定.结果:经过3轮筛选后,特异性结合的噬菌体得到有效的富集,并且Dot-EL[SA反应阳性逐轮增强.测序后发现有4个克隆的序列完全相同,其12肽氨基酸序列为GPHHYWYHLRLP.结论:噬菌体展示肽库技术可以用于筛选HIF-1相关肽,并为后续的活性鉴定打下基础.
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噬菌体随机肽库在确定单抗识别表位中的应用
以抗人感冒病毒凝血素蛋白单克隆抗体12CA5为筛选配基，从丝状噬菌体(M13)表面展示 的随机6肽库中筛选抗体特异性识别的多肽。噬菌体与单抗的结合可以用酶联免疫吸附法鉴 定，而展示的氨基酸序列可以通过测定相应克隆的插入外源核苷酸来确定。筛选所得的多肽 与单抗的表位，特别是C－端的四个氨基酸残基PDYA有高度的同源性，说明该四肽在单抗与 抗原的结合中起到十分重要的作用。
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丙型肝炎病毒非结构蛋白4A人源单链可变区抗体的筛选与鉴定
目的 利用噬菌体表面展示技术，从半合成人源化单链可变区抗体库中筛选、鉴定丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS4A的单链可变区抗体(Scfv)及其编码基因，为抗HCV的细胞内免疫基因治疗研究开辟新途径。方法 采用噬菌体表面展示技术，以重组的HCV非结构蛋白NS4A为包被抗原，从噬菌体单链可变区抗体库中经过3轮"吸附洗脱扩增"筛选过程，获得抗原结合活性较强的HCV NS4A人单链可变区抗体片段阳性克隆，并对其进行免疫学活性及编码基因序列测定。结果 筛选得到的ScFv片段具有抗HCV NS4A的特异性，编码基因符合人源化单链可变区抗体编码基因的特点。结论利用噬菌体抗体库技术，成功获得HCV NS4A的特异性人抗体，为进一步研究HCV NS4A的生物学功能及细胞内免疫抗HCV基因治疗方案奠定基础。
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Nogo-66拮抗性多肽的筛选及其对脊髓损伤大鼠轴突再生的影响
目的:筛选与Nogo-66特异性结合的多肽,并进行初步功能检测.方法:采用了核糖体展示技术,即体外人工合成引物和含36个随机序列的寡核苷酸,通过两轮PCR构建随机DNA文库,然后在体外进行偶联的转录和翻译,得到含随机12肽的核糖体文库,并利用含随机12肽的核糖体文库对Nogo-66进行初步筛选.用ELISA方法检测筛选到的多肽与Nogo-66的亲和力.同时制备大鼠T10节段挫伤模型,损伤后1 d尾静脉注射筛选到的多肽(50 g/50 Ⅰ),HRP逆行染色观察脊髓轴突再生情况.并通过BBB评分观察大鼠神经功能恢复.结果:经过10轮筛选,得到了可与Nogo-66结合的氨基酸序列,合成相应的多肽NAPA,同时合成对照多肽NAPB.ELISA结果显示,NAPA与Nogo-66的亲和力明显高于NAPB与Nogo-66的亲和力(P<0.05).NAPA尾静脉注射4、6周时,实验组大鼠BBB评分明显高于对照组(P<0.05),HRP逆行示踪显示NAPA治疗组的脊髓髓鞘染色清晰,排列规则.结论:筛选得到的Nogo-66的配体多肽NAPA可以明显促进脊髓损伤动物的恢复及脊髓再生.多肽NAPA的筛选成功为脊髓损伤的修复提供新的治疗方法和药物选择.
