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液相色谱法检测市售油炸食品中的叔丁基对苯二酚残留量
目的:采用液相色谱检测市售油炸食品中的叔丁基对苯二酚,并对检测结果进行统计分析.方法:采集市售不同种类的油炸食品,样品经石油醚提取得到油脂,再加入乙腈萃取,离心过滤,上机测定.结果:在0.50~100.00mg/L浓度范围内线性良好,相关系数r=0.9963,方法低检测限为0.05mg/L,RSD=1.35%,加标回收率86.13~93.32%.结论:该方法前处理简便快捷,精密度、准确度好,检测结果准确可靠.
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叔丁基对苯二酚在大鼠体内的代谢研究
目的 利用液相色谱/质谱联用仪(LC/MS)分析叔丁基对苯二酚(TBHQ)在大鼠血清中的代谢物,探讨了TBHQ在大鼠体内的代谢途径.方法 通过一级质谱分析,对大鼠血清中TBHQ的代谢物进行鉴别;通过多级质谱分析,对大鼠血清中的TBHQ及其代谢物进行鉴定.结果 在大鼠血清中检测到TBHQ(3.5%),TBHQ的代谢物包括硫酸型结合物(93.2%)、葡萄糖醛酸型结合物(1.5%)和一种极性不明代谢物(推测为TBHQ二羟基化物的谷氨酸结合物,1.8%).结论 TBHQ在大鼠血清中主要经Ⅱ相反应(与硫酸或葡萄糖醛酸结合)代谢,此外少量TBHQ会发生Ⅰ相反应,推测为氧化反应,生成的二羟基化物与谷氨酸结合.
关键词： 叔丁基对苯二酚 血清中代谢物 液相色谱/质谱联用法 -
Sestrin2/一磷酸腺苷活化的蛋白激酶介导的细胞自噬在糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用及叔丁基对苯二酚预处理的保护作用
目的 探讨Sestrin2/一磷酸腺苷活化的蛋白激酶(AMPK)介导的细胞自噬在糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用及叔丁基对苯二酚(TBHQ)预处理的保护作用.方法 清洁级健康成年雄性SD大鼠60只,体重200~220 g,腹腔注射1%链脲佐菌素60 mg/kg制备大鼠糖尿病模型,采用随机数字表法分为6组(n=10):正常大鼠对照组(NS组)、正常大鼠缺血再灌注组(NIR组)、正常大鼠TBHQ预处理组(NIPC组)、糖尿病大鼠对照组(DS组)、糖尿病大鼠心肌缺血再灌注组(DIR组)、糖尿病大鼠TBHQ预处理组(DIPC组).结扎冠状动脉左前降支30 min,再灌注120 min建立心肌缺血再灌注模型,NIPC组、DIPC组实验前连续5 d腹腔注射TBHQ 40μg/kg.苏木素伊红染色观察心肌组织,酶联免疫法检测肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)水平,Western blotting测定心肌组织Sestrin2、磷酸化AMPK(p-AMPK)、自噬效应蛋白Beclin1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase3)的表达.组间比较采用单因素方差分析.结果 与NIR组相比,NIPC组CK-MB、LDH活性降低(343±37比453±36、428±65比576±45,t=0.0066、0.0134,均P<0.05),SOD活性升高(706±17比566±21,t<0.0001,P<0.05),Sestrin2、p-AMPK、Beclin1表达显著升高(t=0.0004~0.0056,均P<0.05),Caspase3表达降低(t=0.0009,P<0.05).与NS组相比,NIR组和NIPC组CK-MB、LDH、SOD活性显著升高(F=17.04~413.16,均P<0.05),与DS组相比较,DIR组和DIPC组CK-MB、LDH、SOD活性显著升高(F=91.83~183.28,均P<0.05),Sestrin2、p-AMPK、Beclin1、Caspase3表达显著升高(F=8.63~128.69,均P<0.05).与DIR组相比较,DIPC组CK-MB、LDH活性、Caspase3表达显著降低(t=0.0080~0.0227,均P<0.05),SOD活性、Sestrin2、p-AMPK、Beclin1表达明显升高(t=0.0003~0.0069,均P<0.05).结论 TBHQ预处理可能通过上调Sestrin2,激活AMPK通路,进而使线粒体自噬水平增高,减轻糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤.
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叔丁基对苯二酚对皮肤角质细胞核因子Nrf2通路的影响
目的 观察叔丁基对苯二酚(tert-butylhydrquione,tBHQ)对皮肤角质细胞核因子Nrf2 (tanscription factor NF-E2-related factor 2)及其调控的下游靶基因NAD(P)H醌氧化还原酶[NAD(P)H:quinone oxidoreductase1,NQ01]和血红素单加氧酶-1(heme oxygenase1,HO-1)蛋白表达的影响.方法 向HaCaT细胞中加入终浓度为50 μmol/L的tBHQ溶液分别培养0(对照)、2、6、12、24、36 h；或分别加入终浓度为0(对照)、25、50 μmol/L的tBHQ溶液培养24h.采用western blot法检测细胞Nrf2、NQO1和HO-1的蛋白表达.结果 与对照组比较,50 μmol/L的tBHQ染毒2～36 h时HaCaT细胞Nrf2蛋白表达水平,染毒12～36 h时HaCaT细胞NQO1蛋白表达水平以及染毒6～36 h时HaCaT细胞HO-1蛋白表达水平均升高,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).25 μmol/L和50 μmol/L tBHQ分别染毒24h后HaCaT细胞的Nrf2、NQO1和HO-1的蛋白表达水平均高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01).与25 μ mol/L tBHQ染毒组比较,50 μmol/L tBHQ染毒组Nrf2和HO-1蛋白表达水平均下降,NQO1蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 tBHQ能够诱导皮肤角质细胞的核转录因子Nrf2及其调控的下游靶基因NQO1和HO-1的蛋白持续表达,从而对皮肤角质细胞产生保护作用.
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叔丁基对苯二酚对Chng肝细胞无机砷甲基化代谢的影响
目的 探讨叔丁基对苯二酚(tert-butylhydroquinone,tBHQ)对Chang肝细胞无机砷甲基化代谢的影响.方法 将Chang肝细胞密度调整为1×105个/ml,采用25μmol/LtBHQ溶液预处理24 h后,再用5 μmol/L的tBHQ溶液和0.1、0.5、1.0和5.0μmol/L亚砷酸钠溶液联合染毒24 h;并采用0.1、0.5、1.0和5.0 μmol/L亚砷酸钠溶液单独染毒24h;并设溶剂对照(三蒸水).采用超低温捕集-氢化物发生-原子吸收分光光度法分别测定细胞内和培养液中的无机砷(inorganic arsenic,iAs)、一甲基砷(monomethylated arsenic,MMA)和二甲基砷(dimethylated arsenic,DMA)含量,并计算一甲基化率(primary methylationindex,PMI)和二甲基化率(secondary methylationindex,SMI).结果 随着亚砷酸钠染毒剂量的增加,亚砷酸钠单独染毒组和tBHQ+亚砷酸钠染毒组Chang肝细胞内tAs和iAs含量及Chang肝细胞和培养液中的总MMA含量均升高;亚砷酸钠单独染毒组细胞+培养液总DMA含量之间无差异;tBHQ+亚砷酸钠染毒组细胞+培养液总DMA含量呈上升趋势;0.5μmol/L亚砷酸钠单独染毒组和tBHQ+亚砷酸钠染毒组细胞+培养液中的PMI高,然后随着亚砷酸钠染毒浓度的升高而逐渐降低;亚砷酸钠单独染毒组细胞+培养液中的SMI呈逐渐降低,而tBHQ+亚砷酸钠染毒组细胞+培养液中的SMI呈逐渐升高趋势.此外,与相同浓度的亚砷酸钠单独染毒组比较,tBHQ+0.5,1.0、5.0 μmol/L亚砷酸钠染毒组Chang肝细胞内的tAs和iAs含量较低(P＜0.05),而细胞+培养液中总DMA含量、PMI和SMI则较高(P＜0.05).结论 高浓度砷暴露能够抑制砷的二甲基化过程;而tBHQ预处理能够增加砷的甲基化代谢,降低肝细胞内砷含量,从而增强Chang肝细胞对无机砷暴露的解毒能力.
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叔丁基对苯二酚对亚砷酸钠致Chang liver细胞毒性的影响
目的 探讨叔丁基对苯二酚(tert-butylhydroquinone,tBHQ)对亚砷酸钠(NaAsO_2)致Chang liver细胞毒性的影响.方法 Chang liver细胞培养48 h后分别以20、40、60和80 μmo/L的NaAsO_2染毒24和48 h,作为NaAsO_2单独作用组.以5和20μmol/L的tBHQ预处理Chang liver细胞24h,以40和60μmol/L的NaAsO_2染毒24和48h,作为tBHQ预处理组;对照组处理同NaAsO_2:单独作用组.每个浓度设3个复孔.用Alamar Blue法检测细胞活力.结果 NaAsO_2单独作用24和48 h组Alamar Blue还原率显著下降,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);且NaAsO_2单独作用48 h组的Alamar Blue还原率均显著低于24 h组,差异有统计学意义(P＜0.01).5 μmol/L的tBHQ预处理组与对应的60 μmol/L NaAsO_2单独作用24h组相比,显著提高了Alamar Blue还原率(P＜0.01);20 μmol/L的tBHQ预处理组的Alamar Blue还原率均显著高于相对应NaAsO_2单独作用24 h组(P＜0.05).5 μmol/L的tBHQ预处理组的Alaraar Blue还原率均显著高于相对应NaAsO_2单独作用48h组(P＜0.01);20μmol/L的tBHQ预处理组与对应的40μmol/L NaAsO_2单独作用48h组相比,显著提高了Alamar Blue还原率(P<0.01).结论 tBHQ能够降低NaAsO_2致Chang liver细胞的毒性,增强细胞对NaAsO_2毒性的抵抗能力.
关键词： 亚砷酸钠 叔丁基对苯二酚 Chang Liver细胞 -
叔丁基对苯二酚对苯诱导的大鼠骨髓细胞毒性的保护作用
目的探讨叔丁基对苯二酚(tBHQ)对苯诱导的骨髓细胞毒性的保护作用.方法体外培养的大鼠骨髓细胞随机分为对照组和tBHQ预处理组,对照组:以不同浓度(0、5、10、15、20 mmol/L)苯分别染毒骨髓细胞2、4、6 h;tBHQ预处理组:骨髓细胞染苯前先行tBHQ(100 μmol/L)预处理12 h.单细胞凝胶电泳法检测骨髓细胞DNA损伤,流式细胞仪检测骨髓细胞凋亡率,2,6-二氯靛酚还原法测定苯染毒前两组骨髓细胞内依赖还原型辅酶Ⅰ/Ⅱ醌氧化还原酶(NQO1)的活力.结果对照组中随苯染毒浓度的增加、染毒时间的延长,骨髓细胞DNA损伤增强,细胞凋亡率增加.tBHQ预处理组中5、10、15、20 mmol/L苯染毒骨髓细胞的DNA迁移率和迁移度低于同浓度、同时间点的对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);15、20 mmol/L苯染毒2 h及10、15、20 mmol/L苯染毒4 h和5、10、15、20 mmol/L苯染毒6 h骨髓细胞的凋亡率较同浓度、同时间点的对照组降低,差异有统计学意义(P＜0.05);tB-HQ预处理组骨髓细胞内NQO1活力(1.62±0.16 mg pro-1·min-1)高于对照组(0.95±0.08 mg pro-1·min-1),差异有统计学意义(P＜0.01).结论苯可诱导体外培养的大鼠骨髓细胞DNA损伤和细胞凋亡,并呈现一定的时间、剂量依赖性;tBHQ可诱导骨髓细胞NQO1活力增强,对苯诱导的骨髓细胞毒性有保护作用.
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叔丁基对苯二酚对大鼠急性矽尘暴露的保护效果和机制
目的 研究叔丁基对苯二酚(tBHQ)在大鼠急性矽尘暴露中的保护效果及可能机制.方法 将无特定病原体(SPF)级雄性Wistar大鼠随机分为对照组、模型组和干预组,每组32只.模型组与干预组采用一次性非暴露气管染尘法建立大鼠矽尘模型,干预组以质量分数为1％的tBHQ溶液进行干预,对照组以1％的生理盐水进行干预,1次/d.各组分别于3、14、28、60 d处死8只大鼠,用酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定大鼠肺组织中白细胞介素(IL)-1、肿瘤坏死因子(TNF)-α、羟脯氨酸(HYP)、转化生长因子(TGF)-β含量,用比色法测定大鼠肺组织和血清中丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力.结果 与对照组相比,各个时间点模型组和干预组大鼠肺组织中IL-1含量均随时间延长而升高,模型组大鼠肺组织中IL-1含量在60d时达到高,干预组大鼠肺组织中IL-1含量在28 d时达到高,除3d外差异均有统计学意义(P＜0.05);与对照组相比,除3d外,各个时间点模型组和干预组大鼠肺组织中TNF-α含量均增加,差异均有统计学意义(P＜0.05);与对照组相比,各个时间点模型组和干预组大鼠肺组织中HYP、TGF-β含量均随时间延长而升高,在60 d时达到高,差异有统计学意义(P＜0.05);与模型组相比,28、60d干预组大鼠肺组织中IL-1、HYP、TGF-β含量均明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05);与对照组相比,各个时间点模型组和干预组大鼠肺组织和血清中MDA的含量均随着时间延长而升高,差异有统计学意义(P＜0.05);与模型组相比,各个时间点干预组大鼠肺组织中MDA的含量均降低,差异有统计学意义(P＜0.05);与对照组相比,各个时间点模型组和干预组大鼠肺组织和血清中GSH-PX活力均随着时间延长而降低,除3d外差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 tBHQ的干预可以在一定程度上减轻大鼠接触矽尘的氧化应激损伤,提高机体的抗氧化损伤能力,降低肺组织IL-1、TNF-α、TGF-β、HYP的含量,对于急性矽尘接触导致的肺组织炎症和纤维化具有一定的阻碍和抑制作用.
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叔丁基对苯二酚对百草枯神经细胞毒性和氧化应激的拮抗作用
目的 研究叔丁基对苯二酚(tBHQ)预处理对百草枯(PQ)致大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞毒性和氧化应激的拮抗作用.方法 将PC12细胞分为溶剂对照组及100、300 μmol PQ处理组.用终浓度为40 μmol/LtBHQ预处理PC12细胞4 h再分别用终浓度0、100、300 μmol/L PQ处理细胞24或48 h,用噻唑蓝(MTT)法检测细胞毒性,用Annexin V-FITC/PI法流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡,用硫代巴比妥酸法测定细胞丙二醛(MDA)含量.结果 用40μmol/LtBHQ预处理后再用100、300μ,mol/L PQ处理PC12细胞24 h细胞存活率分别较100、300 μmol/L PQ组增高,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01);用40μmol/LtBHQ预处理后再用100μmol/LPQ处理PC12细胞48 h细胞存活率较100μmol/LPQ处理组细胞存活率增高,差异有统计学意义(P＜0.01);用40μmol/LtBHQ预处理后再用100、300μmol/PQ处理PC12细胞24 h后,细胞凋亡率分别较100、300 μmol/L PQ下降,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01);用40μmol/LtBHQ预处理后再用100、300μmol/LPQ处理PC12细胞24 h后,MDA含量分别较100、300 μmol/L PQ组下降,MDA含量分别为相应对照组的0.61、0.57倍,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 tBHQ预处理可削弱PQ致PC12细胞的细胞毒性、细胞凋亡以及氧化应激作用.
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叔丁基对苯二酚对锰致神经细胞毒性的保护作用
目的 研究叔丁基对苯二酚(tBHQ)对锰致大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞毒性的保护作用.方法 以不同终浓度(300、600、900μmol/L)的MnCl2分别处理PC12细胞24、48、72 h,用噻唑蓝(MTT)法检测PC12细胞毒性.MnCl2组予600μmol/L MnCl2处理72 h;tBHQ组予40 μmol/L tBHQ处理细胞84h;tBHQ+MnCl2组予40μmol/L tBHQ预处理12h后,600 μmol/LMnCl2处理72 h,用MTT法检测细胞毒性,MnCl2处理剂量为300 μmol/L时用Annexin V-FITC/PI法流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡.结果 与对照组比较,300、600、900μmol/LMnCl2处理24、48、72h,细胞增殖相对比值降低,差异均有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01);300、600、900 μmol/L MnCl2处理组各组间相互比较,有剂量一效应关系,差异均有统计学意义(P＜0.01).与对照组比较,600 μmol/L MnCl2组抑制PC12细胞增殖,抑制率为40%,差异有统计学意义(P＜0.01).与对照组及MnCl2组比较,tBHQ组和tBHQ+MnCl2组的细胞出现增殖效应,细胞增殖相对比为1.8,差异均有统计学意义(P＜0.01).300μmol/L MnCl2处理组PC12细胞凋亡率明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01),tBHQ+MnCl2组细胞凋亡率低于300μmol/L MnCl2处理组,差异有统计学意义(P＜0.01),细胞凋亡抑制率61%.结论 锰可抑制PC12细胞增殖作用,可诱导细胞凋亡;tBHQ可减弱锰抑制PC12细胞的增殖作用并可削弱锰致PC12细胞凋亡的作用.
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Nrf2-自噬通路在大鼠切口痛-瑞芬太尼诱导痛觉过敏中的作用
目的 探讨切口痛-瑞芬太尼痛敏模型大鼠脊髓内核因子E2相关因子2(Nrf2)-自噬通路在痛觉过敏中的作用.方法24只雄性SD大鼠依随机数字表法分为3组:盐水+切口痛组(I组)、切口痛-瑞芬太尼痛敏组(RI组)、Nrf2激动剂t-BHQ组(t-BHQ组),每组8只.I组和RI组建模前分别经尾静脉输注生理盐水0.1 mL/(kg·min)和瑞芬太尼1 μg/(kg·min),连续输注60 min.t-BHQ组于输注瑞芬太尼前0.5 h腹腔注射t-BHQ(15 mg/kg),12 h 1次,连续4次,余处理同RI组.3组输注同时于双侧后足建立Brennan切口痛模型.分别于输注前24 h(T0)、输注后2 h(T1)、6 h(T2)、24 h(T3)和48 h(T4)测定大鼠机械刺激缩足阈值(PWT)及热刺激缩足潜伏期(PWL).测试完毕后将大鼠处死,取L4~6脊髓节段,Western blot法测定脊髓自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)、Beclin-1、Nrf2及其下游分子血红素氧化酶1(HO-1)表达水平.结果 随着处理时间的延长,3组PWT、PWL呈总体下降的趋势.从T1开始,与I组相比,RI组PWT下降、PWL缩短,T4时LC3Ⅱ、Beclin-1表达升高、Nrf2、HO-1蛋白表达降低(P<0.05);与RI组相比,tBHQ组PWT升高、PWL延长(P<0.05),同时Nrf2、HO-1、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表达均明显升高(P<0.05).结论 Nrf2-自噬通路的激活可明显改善切口痛-瑞芬太尼诱导的痛觉过敏.
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叔丁基对苯二酚对糖尿病大鼠肾缺血再灌注时DJ-1∕Nrf2通路的影响
目的 评价叔丁基对苯二酚( t-BHQ)对糖尿病大鼠肾缺血再灌注时DJ-1∕核因子E2相关因子(Nrf2)通路的影响.方法 SPF级健康雄性SD大鼠40只,体重200～220 g,采用随机数字表法分为4组(n＝10):对照组(C组)、糖尿病组(D组)、糖尿病肾缺血再灌注组(I∕R组)和t-BHQ组(T组).制备糖尿病大鼠肾缺血再灌注损伤模型,T组于术前24 h分3次,每次间隔8 h,腹腔注射t-BHQ 50 mg∕kg,D组和I∕R组给予等容量生理盐水.于再灌注24 h时心尖部采血,测定血清肌酐(Cr)、胱抑素C(Cys C)和β2微球蛋白(β2-MG)的浓度;随后处死大鼠取肾组织,光镜下观察形态学并行病理学评分;采用Western blot法检测DJ-1、Nrf2、血红素氧合酶1 ( HO-1)的表达.结果 与C组比较,D组、I∕R组和T组血清Cr、Cys C、β2-MG浓度和肾组织病理学评分升高,肾组织DJ-1、Nrf2和HO-1表达上调(P＜0. 05);与D组和I∕R组比较,T组血清Cr、Cys C、β2-MG浓度和肾组织病理学评分降低,肾组织DJ-1、Nrf2和HO-1表达上调(P＜ 0. 05).结论 t-BHQ可通过激活DJ-1∕Nrf2通路减轻糖尿病大鼠肾缺血再灌注损伤.
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叔丁基对苯二酚对急性矽尘接触大鼠肺组织醌氧化还原酶表达的影响
选用雄性Wistar大鼠为受试物,采用非气管暴露法构建急性矽尘接触模型,染尘后干预组给予质量分数1％的叔丁基对苯二酚(tBHQ)溶液,对照组给予1％的生理盐水.免疫组化实验发现对照组NQO1蛋白有少量表达;模型组、干预组NQO1蛋白表达增加,干预组NQO1蛋白表达比模型组数量多、表达强.提示tBHQ对其表达具有一定的提升作用.
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tBHQ对亚砷酸钠致胰岛β细胞氧化应激损伤的影响
目的 探讨核因子E2相关因子2 (nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2) 激活剂叔丁基对苯二酚 (tert-butylhydroquinone, tBHQ) 对急性亚砷酸钠 (sodium arsenite, NaAsO2) 所致小鼠胰岛β细胞MIN6氧化应激损伤的影响及其作用机制.方法 采用四甲基偶氮唑蓝 (MTT) 法检测细胞的存活率, 并筛选tBHQ适的处理浓度.根据MTT结果将MIN6细胞分为3组:正常对照组、4μmol/L NaAsO2组、50μmol/L tBHQ预处理+4μmol/L NaAsO2组.通过光学显微镜观察细胞的形态和贴壁数量;二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯 (DCFH-DA) 荧光探针法检测细胞活性氧自由基 (reactive oxygen species, ROS) 含量;Western Blot检测细胞内Nrf2蛋白表达;Real-time RT-PCR检测血红素氧化酶1 (HO-1) 和硫氧还蛋白 (SRX) mRNA表达.结果 与正常对照组相比, 4μmol/L NaAsO2组细胞体积、贴壁数量、存活率均显著下降;而细胞内的ROS含量明显升高.与4μmol/L NaAsO2组相比, 50μmol/L tBHQ预处理后, 显著降低NaAsO2对MIN6细胞氧化应激损伤.tBHQ预处理能够显著增加细胞内的Nrf2蛋白水平, 且HO-1和SRX的mRNA表达均明显高于4μmol/L NaAsO2组.结论 tBHQ可以通过预先激活Nrf2/ARE信号通路, 减轻亚砷酸钠所致小鼠胰岛β细胞的氧化应激损伤, 在此过程中发挥重要保护作用.
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叔丁基对苯二酚拮抗心肌细胞氧化应激损伤机制研究
目的 探讨叔丁基对苯二酚(tBHQ)对化学性低氧模型剂氯化钴(CoCl2)诱发H9c2心肌细胞氧化应激损伤的影响及其作用机制.方法 将细胞分成4组:正常对照组、CoCl2组(500μmol/L CoCl2)、DMSO(二甲基亚砜)+CoCl2(0.005％ DMSO+500μmol/L CoCl2)组、tBHQ+CoCl2(50μmol/L tBHQ +500μmol/L CoCl2)组;MTT法检测细胞生长活性;DCFH-DA探针测定细胞内ROS含量;Western Blot检测细胞内cleaved-caspase-3和Nrf2及其调控的Ⅱ相解毒酶NAD(P) H:醌氧化还原酶1(NQO1)和抗氧化酶γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶(GCLC)蛋白的表达;应用Real-time PCR检测NQO1和GCLC mRNA表达.结果 CoCl2组与正常对照组相比,细胞活性明显降低,细胞内的cleaved-caspase-3蛋白表达显著升高,ROS含量增高;DMSO+CoCl2组与CoCl2组无差异;tBHQ预处理能够显著降低CoCl2对H9c2心肌细胞氧化应激损伤.与CoCl2组相比,tBHQ预处理能够显著增加细胞内的Nrf2蛋白水平,且细胞内NQO1和GCLC的mRNA及蛋白表达均明显高于CoCl2组.结论 tBHQ能够诱导H9c2心肌细胞内Nrf2的蛋白表达,进而上调其下游Ⅱ相解毒酶NQO1和抗氧化酶GCLC的转录活性及蛋白表达,拮抗CoCl2诱发的化学性缺氧对H9c2心肌细胞的氧化应激损伤.
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叔丁基对苯二酚对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究
目的:探讨叔丁基对苯二酚在大鼠脑缺血再灌注中的神经保护作用及可能机制.方法:将SD雄性大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、缺血再灌注加溶剂治疗组、缺血再灌注加叔丁基对苯二酚治疗组,分别于再灌注后24h对大鼠进行行为学评分,采用免疫印迹法检测叔丁基对苯二酚对Nrf2蛋白表达的影响,TUNEL法检测神经细胞的凋亡,酶联免疫吸附法检测炎性因子TNF-α和IL-1β的表达,同时检测超氧化物歧化酶和丙二醛的含量.结果:与假手术组相比,叔丁基对苯二酚可以显著上调Nri2蛋白的表达(P＜0.05)和SOD的活性(P＜0.05),显著减少MDA的表达量(P＜0.05),抑制TNF-α和IL-1β的表达量(P＜0.05).结论:叔丁基对苯二酚可以在大鼠脑缺血再灌注损伤中发挥显著地神经保护作用,其机制可能与上调Nrf2信号通路相关.
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NQO1在tBHQ干预急性CO中毒后迟发性脑病大鼠海马区的表达及作用
目的 探讨醌氧化还原酶1(NQO1)在叔丁基对苯二酚(tBHQ)干预大鼠急性CO中毒后迟发性脑病(DEACMP)模型中海马区的表达及作用.方法 180只大鼠中随机抽样出60只作为空气对照组(AC组)、60只作为一氧化碳中毒组(CO组)、60只作为一氧化碳中毒+tBHQ组(TC组),,每组按染毒后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d随机分为6个亚组,动态监测染毒前后大鼠动脉血中HbCO浓度,水迷宫实验检测大鼠平均逃避潜伏期、穿越平台频次、平台象限游泳时间记录其学习记忆能力的变化,Tunel法检测大鼠海马CA1区凋亡细胞,免疫组化法、Western Blot法检测大鼠海马区NQO1蛋白的表达情况.结果 成功建立120只大鼠急性CO中毒模型,TC、CO组大鼠的动脉血HbCO浓度持续超过16 h大于50％,且水迷宫实验发现以上两组大鼠在14 d开始出现学习记忆能力下降,且TC组大鼠变化较CO组更显著(P<0.05).TC、CO组大鼠的细胞凋亡指数均较AC组升高(P<0.05),呈现先升高后降低趋势,在7 d达凋亡高峰(7 d:TC组:23.041.89,CO组:25.522.11),TC组与CO组比较,1～7 d低于CO组,21～28 d高于CO组,差异具有统计学意义(P<0.05).TC、CO组大鼠海马CA1区NQO1的表达均较AC组升高(P<0.05),从1 d开始升高,3 d达峰点(TC组:9.560.83,CO组:8.080.58)而后缓慢下降的走势,且TC组与CO组、AC组各相同时间点比较差异具有统计学意义(P<0.05).结论 ACOP中毒后大鼠海马区NQO1的表达升高,与细胞凋亡情况呈正相关,在染毒后3 d内NQO1表达增加发挥抗氧化应激损伤的保护作用,而后NQO1继续高表达推动海马区细胞发生迟发性凋亡、促进DEACMP的发病.
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tBHQ和SFN在创伤性脑损伤小鼠中的疗效比较性分析
目的:探讨叔丁基对苯二酚(tBHQ)和莱菔硫烷(SEN)在患有创伤性脑损伤大鼠的疗效差异性.方法:80只健康成年的雄性SD大鼠分为假手术组、常规损伤组、tBHQ治疗组和SFN治疗组,使用电子颅脑损伤仪(eCCI)制备TBI模型.其中tBHQ治疗组在伤前24 h大鼠腹腔注射三次tBHQ(50 mg/kg),每8h一次;SFN治疗组在伤后15 min给予腹腔注射SFN(5 mg/kg).给药24h后,采用mNSS方法评价各组大鼠神经功能缺损状况,利用干湿称量法计算脑含水量,Western blot和ELISA方法分别测定大鼠脑组织的NOX2和Nrf2的表达水平.结果:损伤发生后第24 h,tBHQ治疗组和SFN治疗组在mNSS评分((4.5±0.71)vs(9.2±0.79),(6.0± 0.82) vs (9.2± 0.79))、脑水肿(79.4％ vs 85.6％,80.3％ vs 85.6％)、NOX2和Nrf2(0.93 ng/mL vs 0.81 ng/mL,0.87 ng/mLvs 0.81 ng/mL)表达上与常规损伤组差异明显,而tBHQ治疗组和SFN治疗组间在mNSS评分((4.5±0.71)vs(6.0±0.82))、NOX2和Nrf2(0.93 ng/mL vs 0.87 ng/mL)表达上差异显著.结论:在大鼠TBI模型中,tBHQ和SFN均可以有效的降低机体自身的氧化应激作用,并改善神经功能,但tBHQ的疗效要好于SFN.
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MTT法用于药物对L2细胞毒性的实验研究
目的:评价噻唑蓝(MTT)法检测药物对细胞的毒性作用的可靠性.方法:大鼠肺泡上皮L2细胞以叔丁基对苯二酚(TBHQ)10-100 μM,BSO以1-10mM分别处理,用MTT法检测细胞活性、JC-1(5,5',6,6'-四氯-1,l',3,3'-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物)荧光染料法检测细胞线粒体电位改变、台盼蓝排斥实验检测细胞死亡率,分析各指标的情况.结果:在处理剂量范围,MTT法检测到的光密度(OD)值未能达到一般判断的半数抑制浓度(IC 50)水平,高抑制率仅达到30％左右；台盼蓝排斥试验检测数据表明TBHQ的LC 50值为50μM,丁硫氨酸亚砜胺(BSO)为5mM；利用JC-1荧光染料判断的半数凋亡剂量分别为50 μM和7mM.结论:MTT法作为常采用的细胞生长抑制检测手段,但在某些特定实验中可能不能客观地反映细胞的活性,建议多种方法结合进行评价.
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叔丁基对苯二酚对亚砷酸钠致细胞毒性和氧化损伤的拮抗作用
目的 探讨叔丁基对苯二酚(tBHQ)对亚砷酸钠(NaAsO2)致细胞毒性和氧化损伤的拮抗作用。方法 Chang肝细胞用tBHQ[0(对照)、5、25μmol/L]预处理24h,再用5 μmol/L tBHQ和NaAsO2[0(对照)、30、40、50、60 μmol/L]共同作用24h,采用刃天青钠(Alamar blue)还原法检测细胞活力，结果用实验组Alamar blue还原率与对照组Alamar blue还原率的相对比值表示；Chang肝细胞用tBHQ[0(对照)、5、25 μmol/L]预处理24h,再用5μmol/L tBHQ和NaAso2[0(对照)、40、50 μmol/L]共同作用24h，采用荧光探针2′，7′-二乙酰二氯荧光素(DCFH-DA)检测细胞内活性氧(ROS)的生成，结果用实验组平均荧光强度与对照组平均荧光强度的相对比值表示。结果 30、40、50、60 μmol/L的NaAsO2暴露能够显著降低细胞活力，而tBHQ预处理(5、25 μmol/L)则可明显恢复细胞活力,NaAsO2和tBHQ两因素的主效应及其交互作用均有统计学意义（F值分别为566.57、55.09、14.50，P均＜0.05）；5、25 μmol/L tBHQ预处理的30、40、50、60 μmol/LNaAsO2组细胞活力(0.75±0.02、0.70±0.04、0.59±0.03、0.43±0.03和0.75±0.02、0.73±0.03、0.65±0.02、0.50±0.02)较相应NaAsO2单独作用组(0.70±0.03、0.64±0.03、0.43±0.03、0.33±0.01)显著升高（P均＜0.05），25 μmol/L tBHQ 预处理的50、60μmol/L NaAsO2组细胞活力高于相应5μmol/L tBHQ预处理组（P均＜0.05）。40、50 μmol/L的NaAsO2能显著诱导Chang肝细胞内ROS的产生，而tBHQ预处理(5、25 μmol/L)则可使NaAsO2诱导产生的细胞内ROS水平显著下降，NaAsO2和tBHQ两因素的主效应及其交互作用均有统计学意义（F值分别为181.78、60.55、4.93，P均＜0.05）;5、25 μmol/L tBHQ预处理的40、50 μmol/L NaAsO2组细胞内ROS水平(1.87±0.09、1.80±0.07和1.36±0.11、1.44±0.12)较相应NaAsO2单独作用组(2.30±0.18、2.18±0.17)显著降低(P 均＜ 0.05)，25 μmol/L tBHQ预处理的40、50 μmol/L NaAsO2组细胞内ROS水平低于相应5μmol/L tBHQ预处理组（P均＜ 0.05）。结论 tBHQ对NaAsO2诱导的细胞毒性和氧化损伤具有一定的拮抗作用。
