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转录调节因子p8分泌表达载体的构建及在Fx293细胞中的表达
目的:构建可以产生分泌型转录调节因子p8重组蛋白的载体,期望进一步研究p8的功能.方法:利用定点诱变的方法在pDisplay表达载体中去除HA和Myc标记序列,保留小鼠Igκ信号肽和PDGFR跨膜结构域.在小鼠Igκ信号肽后是外源p8、凝血因子Xa识别位点和Flag序列,与PDGFR跨膜结构域形成融合基因.PCR扩增得到完整表达片段后用于慢病毒载体上的克隆,之后在包装细胞Fx293中产生重组慢病毒用于后续实验.结果:经测序证实所构建的质粒序列与预期序列一致,酶切和PCR验证质粒构建正确,体外转染Fx293细胞后产生重组蛋白.结论:成功构建体外可以产生p8的慢病毒载体,为体外产生重组分泌的p8多肽和体外鉴定与p8结合的蛋白分子实验奠定基础.
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衔接蛋白p66Shc CH2结构域分泌表达载体的构建及其表达
目的:构建可以产生分泌p66Shr CH2结构域重组蛋白的质粒,期望进一步研究p66Shc的功能.方法:利用定点诱变的方法在pDisplay中去除HA和Myc表达序列,但保留小鼠Igκ信号肽和PDGFR跨膜结构域.在小鼠Igκ信号肽后是外源CH2结构域、凝血因子Xa识别位点和Flag序列,与PDGFR跨膜结构域形成融合基因.PCR扩增得到完整表达片段后用于慢病毒载体上的克隆,之后在包装细胞Fx293中产生重组慢病毒用于后续实验.结果:经测序证实所构建的质粒序列与预期序列一致,酶切和PCR验证质粒构建正确,体外感染细胞后产生重组蛋白.结论:成功构建体外可以产生p66ShcCH2结构域的慢病毒载体,为体外产生重组分泌的CH2多肽和体外鉴定与p66ShcCH2结构域结合的蛋白分子实验奠定基础.
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白纹伊蚊C6/36细胞登革Ⅱ型病毒结合分子的筛选
目的 筛选白纹伊蚊C6/36细胞表达连接登革Ⅱ型病毒分子.方法 提取C6/36细胞的总蛋白和膜蛋白,收集和纯化登革Ⅱ型病毒,用12％SDS-PAGE分析C6/36细胞的总蛋白和膜蛋白,转于硝纤膜上,用病毒覆盖蛋白结合实验(VOPBA)筛选C6/36细胞表达连接登革Ⅱ型病毒分子.结果 C6/36细胞的总蛋白和膜蛋白经12％ SDS-PAGE分离后转膜,分别与纯化的病毒液和阴性对照液孵育,用抗登革病毒Ⅰ～Ⅳ单克隆抗体检测,结果显示病毒孵育组在67 000和30 000的位置有特异性的条带出现,而阴性对照组无此条带.结论 用VOPBA法初步从白纹伊蚊C6/36细胞中筛选67 000和30 000等登革Ⅱ型病毒结合分子,其功能的鉴定正在进行.
关键词： 白纹伊蚊C6/36细胞 登革Ⅱ型病毒 结合分子 筛选 -
应用噬菌体展示技术筛选人树突状细胞的特异结合分子
目的:从人肝癌T7 cDNA噬菌体展示肽库中筛选出能与人未成熟树突状细胞(iDC)特异结合的蛋白分子.方法:以人iDC为固相筛选目标,对人肝癌T7 cDNA噬菌体肽库进行4轮生物淘选,ELISA鉴定噬菌体单克隆.阳性克隆经PCR扩增并测序后行同源性比对分析.结果:4轮筛选富集现象不显著,获得80个只与人iDC特异性结合的阳性克隆.测序显示部分克隆序列相同,生物信息学比对发现与人iDC特异结合的阳性噬菌体克隆的同源蛋白中,可能与肝癌发生相关的分子有:人铁蛋白轻链、甲胎蛋白、α1微球蛋白前体、G蛋白偶联受体116和跨膜蛋白49等.结论:从人肝癌17 cDNA噬菌体肽库中筛选获得了能与人iDC特异结合的分子,为阐明人肝癌发生发展过程中肿瘤免疫逃逸相关机制奠定了基础.
