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两种嵌合乙型肝炎病毒preS1中和表位的乙肝核心病毒样颗粒的制备与抗原性分析
目的 构建嵌合preS1 21-47位氨基酸(aa)、以全长乙肝病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)为骨架的病毒样颗粒H2和嵌合preS1 aa 37-45、以截断HBcAg为骨架的病毒样颗粒H3,并对比其抗原性.方法 将HBVadr血清型preS1中和表位aa 21-47和aa 37-45分别插入到全长HBc(aa 1-183)和截断HBc (aa 1-144)的第78位天冬氨酸和第79位脯氨酸之间,密码子优化之后全基因合成,目的片段经双酶切(NdeI和XhoI)回收后连接到同样处理的pET43.1a载体上,在大肠埃希菌E.coli BL21(DE3)中表达,精细纯化后通过电镜观察蛋白形态、ELISA以及Western Blott检测其抗原性.结果 成功构建表达质粒H2和H3,并在BL21(DE3)中高效表达和自发组装成病毒样颗粒.纯化后电镜观察H2和H3形态为二十面体立体对称样病毒样颗粒,H2为实心颗粒,直径为(31.61±1.27) nm,H3为空心颗粒,直径为(28.46 ±1.16) nm.统计分析可得H2直径要比H3直径大(P＜0.01).ELISA和Western Blott检测结果证实其插入表位preS1以及载体蛋白HBc的抗原性.结论 成功获得两种嵌合HBV preS1中和表位的病毒样颗粒,为其在疫苗研究中的应用探索奠定基础.
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抗菌肽LL-37抑制呼吸道合胞病毒复制的核心功能区的研究
目的 研究抗菌肽LL-37抑制呼吸道合胞病毒复制的核心功能区.方法 ①根据LL-37的氨基酸序列,合成从N-端到C-端的系列短肽P1到P6.②RSV感染Hep-2细胞,同时分别加入LL-37和合成的不同短肽,用实时定量聚合酶链反应检测RSV N基因的表达,分析LL-37和各种短肽对RSV复制的影响.③Hep-2细胞分别加入LL-37和不同的短肽,用酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞培养液中趋化因子RANTES、IL-8及MCP-1的表达水平.结果 ①根据LL-37合成的N-端短肽不具有抑制RSV复制的功能(P＞0.05),但不同区段的C-端短肽可不同程度地抑制RSV的复制(P＜0.05或P＜0.01).②LL-37可诱导趋化因子IL-8、RANTES和MCP-1的表达(P＜0.05),但C端短肽P6对上述趋化因子的表达没有影响(P＞0.05).结论 由LL-37的C-端22氨基酸残基组成的区域是抑制RSV复制的核心功能区.LL-37可诱导趋化因子IL-8、RANTES和MCP-1的表达,但C-端短肽不能诱导趋化因子的表达.
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丙型肝炎病毒核心蛋白转染HepG2细胞对其p53表达的影响
目的 研究丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV-core protein,HCV-C)对HepG2细胞周期、细胞凋亡和p53蛋白表达的影响.方法 表达HCV-C的真核表达质粒pcDNA3.1-core,通过Lipofectamine基因转染法转染HepG2细胞,经G418筛选获得稳定转染HepG2细胞,经Western Blot证实HCV核心蛋白阳性表达.利用四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法,平板克隆实验和流式细胞术,蛋白印迹和免疫细胞化学法检测HCV核心蛋白对细胞生长增殖率、细胞周期、细胞凋亡率和p53蛋白表达的影响.结果 HCV-C转染组细胞增殖率显著高于空白质粒转染组和未转染组;HCV-C转染组细胞S期所占百分率高于未转染组;HCV-C转染组细胞凋亡率显著低于未转染组;HCV-C转染组细胞突变型p53蛋白的表达高于空白质粒转染组和未转染组.结论 HCV核心蛋白可能通过促进突变型p53蛋白的表达,促进HepG2从G0/1期进入S期,促进细胞生长增殖,抑制细胞凋亡.
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环孢素A促进HepG2.2.15细胞中乙型肝炎病毒核心蛋白入核的研究
目的 观察磷酸脂酶抑制剂环孢素A(CSA)对HBcAg表达和定位的影响,了解HBV生活的周期.方法 以30 μg/ml的CSA处理HepG2.2.15细胞2 d或4 d;共聚集显微镜观察细胞内HBcAg和HBsAg亚细胞定位;TUNEL方法检测细胞凋亡.结果 对照组HepG2.2.15细胞中HBcAg主要定位于胞质.CSA处理2 d后可使胞质中HBcAg和HBsAg水平下降,细胞核内HBcAg水平升高,可见约5%细胞发生凋亡.CSA处理4 d后细胞核内HBcAg水平进一步提高,约25%细胞核内表达强度明显高于胞质,并约有30%细胞发生凋亡.结论 CSA可促使HepG2.2.15细胞内HBcAg进入细胞核.HBcAg的核内表达定位增强可能与蛋白磷酸化水平增高,及细胞衰老或者凋亡有关.
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HBV核心启动子A1762T/G1764A双突变与慢加急性肝衰竭关系的研究
目的 分析HBV BCP A1762T/G1764A双突变与慢加急性肝衰竭(Acute on chronic liver failure,ACLF)之间的相关性.方法 对166名HBV慢性感染后处于疾病不同阶段的患者进行HBV前BCP A1762T/G1764A双突变检测,比较不同患者之间突变率的差异.结果 慢性肝炎(CHB)45人,肝硬化(LC)45人,ACLF 49人,肝细胞癌(HCC)27人,各组A1762T/G1764A双突变率分别为40.0%(18/45)、84.4%(38/45)、73.5%(36/49)、92.6%(25/27).但是,以CHB为基础的ACLF患者和以LC为基础的ACLF患者A1762T/G1764A双突变率差异无统计学意义[(81.3%)vs.(69.7%),P=0.502].HBeAg阳性者和HBeAg阴性者BCP双突变率差异无统计学意义(P=0.735).A1762T/G1764A双突变者HBV DNA水平(10g)为5.68±1.36,阴性者HBV DNA水平(log)为6.14±1.81,差异无统计学意义(P=0.075).结论 A1762T/G1764A双突变与HBV感染后疾病进展相关,不具备ACLF特异性;A1762T/G1764A联合突变者HBV DNA水平及HBeAg状态也与非联合突变者差异无统计学意义.
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HCV Core蛋白与IFN敏感性相关结构及功能的生物信息学分析
目的 生物信息学工具分析不同基因型HCV Core蛋白与IFN敏感性相关的结构功能及差异.方法 应用生物信息学工具对不同基因型HCV Core蛋白二级结构、三级结构、修饰位点及主要功能结构域预测分析.结果 HCV Core蛋白氨基酸序列、二级结构、三级结构各型间存在差异,可能存在酰胺化、cAMP依赖的激酶、PKC、TYR磷酸化等修饰位点及与两性蛋白SH3结构域、ERK、PKC相互作用的区域.结论 不同基因型HCV Core蛋白结构功能不同影响IFN治疗敏感性.
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应用噬菌体随机肽库研究丙型肝炎病毒核心蛋白B细胞抗原表位
目的 探索利用特异多克隆抗体结合噬菌体递呈(phage display)随机肽库,进行病原体蛋白质的B细胞抗原表位研究.方法 采取特异抗原→特异多克隆抗体→相应抗原表位的技术路线.所选研究对象为丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白.实验分三步:(1)抗HCV核心蛋白多克隆抗体的制备.用活化的Sepharose 4B耦联重组的HCV核心蛋白,亲和层析纯化丙型肝炎病人血清中特异的抗核心蛋白多克隆抗体.(2)随机肽库的生物淘洗(biopanning).以纯化的多克隆抗体作为筛选分子,生物淘洗噬菌体递呈的随机七肽库.(3)阳性噬菌体克隆的鉴定.将筛选的噬菌体克隆进行ELISA检测、DNA测序以及竞争抑制试验等,后分析所获资料.结果 七肽氨基酸序列分析表明,HCV核心蛋白存在着至少3个B细胞抗原位点,其中19～25aa间(PQDVKFP)的线性表位是该蛋白的优势表位,证实了本研究策略的可行性.结论 本技术路线可以有效地进行HCV核心蛋白的B细胞抗原表位研究.由此推论,此方法也可移植于其它病原微生物抗原或自身抗原的表位研究,继而为基于抗原表位水平的特异诊断试剂的研制、疫苗的设计提供依据.
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丙型肝炎病毒核心蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定研究
目的构建含丙型肝炎病毒（ hepatitis C virus，HCV）核心（ core，C）蛋白基因的酵母双杂交诱饵载体，为C蛋白与宿主蛋白相互作用机制研究奠定基础。方法聚合酶链反应（ PCR）法扩增HCV 1b基因型C蛋白基因，经EcoR I和Pst I双酶切后插入到诱饵载体pGBKT7中，构建含HCV C蛋白基因的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-Core，经酶切分析及核酸测序分析加以鉴定。醋酸锂法将pGBKT7-Core转化入酵母菌株Y2HGold，蛋白印迹法检测C蛋白的表达，通过表型筛选检测诱饵蛋白对酵母细胞的毒性作用及对报告基因的激活作用。结果重组质粒pGBKT7-Core中的C蛋白基因为576 bp，经核酸测序分析与NCBI中注册的HCV 1b基因型C蛋白基因序列一致；转化酵母菌后检测到C蛋白的表达；HCV C蛋白对酵母菌Y2HGold无毒性，且对报告基因无激活作用。结论含HCV C蛋白基因的酵母双杂交诱饵载体构建成功，表达稳定。
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HCV核心基因cDNA真核表达载体的构建及其表达
丙型肝炎病毒(HCV)感染具有明显的慢性化倾向,与肝细胞癌(HCC)发生关系密切,是肝癌的病因之一[1-21].近年来HCV核心蛋白的作用受到重视,被认为具有基因调节功能[22-24].我们采用基因重组技术构建HCV核心基因cDNA真核表达质粒,导入HepG2细胞株,以期获得永久性表达HCV核心蛋白的细胞,为进一步探讨HCV核心蛋白的致癌机制提供实验模型.
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丙型肝炎病毒核心蛋白对细胞凋亡的影响
目的 考察丙型肝炎病毒核心蛋白对细胞凋亡的影响,以期从另一个角度研究丙型肝炎病毒可能的致癌机理.方法应用流式细胞仪检测HepG2-C细胞和HepG2-CMV细胞对氨甲喋呤(MTX 10mg/L)和去血清的耐受.并进一步检测凋亡相关基因及产物的表达.结果应用流式细胞仪检测HepG2-C细胞和HepG2-CMV细胞对氨甲喋呤(MTX 10mg/L)的耐受,结果HepG2-C细胞24小时和48小时的凋亡率分别为5.1%和9.6%,而HepG2-CMV细胞为6.8%和16%.而去血清2,4,6天的HepG2-C细胞凋亡率分别为6.6%,9.4%,11.5%,而HepG2-CMV细胞分别为11.4%、13.5%、16.1%.表明表达丙肝病毒核心蛋白的细胞HepG2-C较转染空载体的细胞HepG2-CMV耐受凋亡.在进一步分子机理的探讨中发现HepG2-C细胞P53,C-myc,Bc1-2表达增加,而Fas表达减低,转录水平也发生同样的变化.结论丙肝病毒核心蛋白可能通过调节基因转录与表达,抑制某些因素引起的细胞凋亡.
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丙型肝炎病毒核心蛋白通过活化stat3通路促进肝癌细胞上皮间质转化的研究
目的 探讨丙型肝炎病毒核心蛋白(HCVc)对肝癌细胞信号转导子和转录激活子3(stat3)通路及上皮间质转化(EMT)的影响.方法 将含HCVc基因序列的重组质粒pEGFP-N3-HCVc转染人肝癌细胞HepG2,Real-Time PCR和Western blotting检测HCVc、总stat3、磷酸化stat3(p-stat3)及EMT指标蛋白E-cadherin、Vimentin、Snail的表达,划痕实验及Transwell实验检测细胞迁移和侵袭情况.结果 划痕实验及Transwell实验结果显示,过表达HCVc可增强HepG2细胞的迁移和侵袭能力;stat3通路抑制剂AG490处理可抑制HepG2细胞的侵袭能力.RT-PCR和Western blotting结果显示,过表达HCVc后,HepG2细胞中p-stat3、Vimentin及Snail在表达升高, E-cadherin表达下降;AG490处理可下调p-stat3、Vimentin及Snail表达,增强E-cadherin表达.结论 HCVc可活化stat3通路促进肝癌细胞上皮间质转化,增强肝癌细胞的迁移和侵袭能力.
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应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因
应用抑制性消减杂技术构建丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCV核心蛋白反式激活相关基因.以HCV核心表达质粒pcDNA3.1(-)-core转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa I酶切后将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果显示,成功构建人HCV核心蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到233个白色克隆,进行菌落PCR分析,其中213个均得到100～1 000 bp插入片段.挑取63个插入片段测序分析,其中6个cDNA片段为未知序列,通过生物信息学分析获得其全长序列,已被GenBank收录.提示6个新的cDNA全长序列,可能是HCV核心蛋白反式激活靶基因.
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丙型肝炎病毒核心蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化
报道两种长度的HCV核心基因片段在E.coli中的表达结果.从HCV感染者的血清扩增出核心区基因,利用表达质粒pQE-30,构建了两种重组质粒,其插入片段分别为HCV的全长核心区基因(c573)和"截断型"基因(c375).经IPTG诱导,含两种质粒的菌株都表达了目的蛋白,c573表达的蛋白分子量为22kD,表达量占菌体蛋白的8.7%;c375表达的蛋白分子量为19kD,表达量占菌体蛋白的39.9%.经Ni-NTA金属螯合层析纯化,获得了高纯度的目的蛋白.这两种蛋白均可特异地与丙型肝炎病人血清发生反应,表明具有良好的抗原活性.
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抗丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体的制备及免疫组织化学研究
目的制备丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体并进行免疫组织化学研究.方法以大肠杆菌表达的重组丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白为固相抗原,利用抗原-抗体亲和性结合的原理,从半合成的人源可变区噬菌体抗体库中经过3轮"吸附-洗脱-扩增"的筛选过程及酶联免疫吸附试验(ELISA)和DNA序列分析,获得HCV核心蛋白的人源单链抗体;用该抗体对7721转染全长HCV cDNA后筛选的阳性克隆细胞中的HCV核心蛋白抗原进行免疫组化鉴定.结果ELISA结果表明,制备的HCV核心蛋白人源单链抗体能与HCV核心蛋白抗原特异性结合;免疫组化结果表明,该抗体能够特异性识别HCV核心蛋白抗原,与正常肝细胞无交叉反应.结论此法制备单链抗体方法简便,周期短,可为HCV核心蛋白病原的检测提供新的检测手段.
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丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体在大肠杆菌中的表达
目的在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体.方法采用噬菌体表面展示技术,将丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白单克隆抗体固相包被于Nunc板.从人源噬菌体单链可变区抗体库中经过3轮"吸附-洗脱-扩增"的筛选,获得结合活性较强的人源HCV核心蛋白抗独特型(抗-Id)scFv阳性克隆.从阳性克隆中提取质粒,经Sfi I/NotI酶切鉴定后,亚克隆到pCANT-AB5E载体,转化大肠杆菌XL1-Blue,应用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达可溶性的HCV核心蛋白抗独特型单链可变区抗体.酶联免疫吸附法(ELISA)证实表达的HCV核心蛋白抗-ID scFv具有与HCV核心蛋白单克隆抗体反应的特异性.对转化的大肠杆菌XL1-Blue上清中表达的HCV核心蛋白抗-Id scFv进行硫酸铵沉淀,并进行SDS-PAGE电泳.结果筛选得到的HCV核心蛋白抗-IdscFv片段基因由774bp组成.SDS-PAGE电泳表明,大肠杆菌XL1-Blue中表达的可溶性HCV核心蛋白抗-Id scFv分子量约28kD.结论HCV核心蛋白抗-Id scFv与HCV核心蛋白抗-Id scFv单克隆抗体具有较强的结合活性和特异性.HCV核心蛋白抗-Id scFv的筛选和表达成功,为今后HCV核心蛋白抗-Id scFv的研究和应用奠定了基础.
关键词： C型肝炎样病毒属 病毒核心蛋白质类 抗独特型单链可变区抗体 基因表达 -
丙型肝炎病毒核心蛋白core与其结合蛋白HCBP6在哺乳动物细胞中的相互作用
目的 探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白core与其结合蛋白HCBP6在哺乳动物细胞中的相互作用.方法 分别扩增HCV核心蛋白core及其结合蛋白HCBP6的cDNA片段,克隆人pGEM-T载体.测序正确后应用双杂交技术把目的片段分别插入哺乳动物细胞双杂交系统的表达质粒pBIND和pACT中构建重组载体.将构建的pBIND-core和pACT-HCBP6重组载体和报告质粒pG5luc共转染HepG2细胞,并设背景对照组(pBIND+pACT)、阳性对照组(pBIND-Myod+pACT-Id)、2个阴性对照组(pBIND-core+pACT、pBIND+pACT-HCBP6)和空白对照组.采用Dual-荧光检测系统和Turner Biosystems Veritas微孔板化学发光检测仪检测荧虫素酶活性.结果 成功构建重组载体pBIND-core和pACT-HCBP6,共转染HepG2细胞之后,其荧虫素酶活性与海肾素酶活性的比值与各对照组相比有统计学差异(P≤0.05).结论 HCV核心蛋白core与其结合蛋白HCBP6在肝癌细胞系中确有一定的相互作用,为进一步阐明HCV核心蛋白在细胞凋亡及细胞恶变中的作用机制提供了新的思路.
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HCV核心蛋白诱导肝细胞侵袭性的体外研究
目的:探讨HCV核心蛋白对肝细胞侵袭性的影响.方法:构建HCV核心蛋白真核表达载体pIRES-core,稳定转染L02细胞,通过间接免疫荧光和Western印迹方法检测核心蛋白的表达,电镜观察肝细胞的形态变化,用体外迁移侵袭力实验测定转染HCV核心蛋白肝细胞的迁移侵袭的能力.结果:未转染细胞L02和转染空载体细胞相比,转染HCV核心蛋白细胞表达基质金属蛋白酶诱导物(EMMPRIN)的水平升高,并且该细胞的迁移侵袭能力明显升高(P<0.01).结论:HCV核心蛋白可能通过上调EMMPRIN的表达以提高肝细胞的迁移侵袭能力,为进一步探讨核心蛋白如何诱导肝细胞侵袭性奠定了基础.
关键词： 肝炎病毒 病毒核心蛋白质类 基质金属蛋白酶诱导物 侵袭性 -
丙型肝炎病毒核心蛋白不同区段在HEK293T细胞内的定位
目的:为进一步探讨HCV核心蛋白致癌机制,观察了HCV核心蛋白不同区段在HEK293T细胞内的定位情况.方法:构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和不同长度核心蛋白区段融合表达的pEGFP-C1系列重组载体,对HEK293T细胞进行瞬时转染,并在激光扫描共聚焦显微镜下观察核心蛋白不同区段在细胞内的定位.结果:全长核心蛋白定位于细胞质;核心蛋白1～59 aa区段完全定位于细胞核;50～140 aa区段和1～140 aa区段在细胞核和细胞质中均存在;130～191 aa区段完全存在于细胞质中.结论:核心蛋白不同区段在细胞内的定位不同,将导致其参与细胞调节的途径和功能的不同.
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丙型肝炎病毒核心蛋白基因的表达载体构建及在酵母中的表达
目的:为探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心(core)蛋白的功能,在真核生物酵母细胞中表达HCV核心蛋白基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)的方法在HCV全长质粒pBRTM/HCV为膜板扩增HCV核心蛋白基因,克隆到pGEM-T 载体中,双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGBKT7中表达.提取酵母蛋白质,进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western免疫印迹分析.结果:成功构建HCV核心蛋白基因酵母表达载体,Western 免疫印迹显示了HCV核心蛋白在酵母细胞中表达.表达产物在胞内存在,分子量 22 000 ku 左右.结论:HCV核心蛋白在酵母中表达成功.
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丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6的反式调节基因研究
目的:筛选、克隆新基因HCBP6转染肝癌细胞后的反式调节基因,探索HCBP6基因表达对肝细胞基因表达谱的影响.方法:应用酵母双杂交技术和生物信息学(bioinformatics)技术,筛选得到的人HCV核心蛋白结合蛋白6(HCBP6)的基因.构建HCBP6基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-HCBP6,应用抑制性消减杂交技术对重组表达质粒pcDNA3.1(-)-HCBP6转染的HepG2细胞和空载体转染的相同细胞差异表达的mRNA进行研究,将富集的二次PCR产物与T/A载体连接,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑取克隆聚合酶链反应(PCR)扩增后进行测序及同源性分析.结果:消减文库扩增后得到 30 个阳性克隆,菌落PCR分析显示,其中 24 个克隆含有200～1 000 bp插入片段.对插入片段测序,并通过生物信息学分析,结果共获得11种蛋白编码基因.结论:应用SSH技术成功筛选了HCBP6对肝癌细胞的反式调节基因,本实验结果对初步探索新基因的功能提供重要的信息,为进一步阐明HCV核心蛋白与HCBP6相互作用后的肝细胞生物大分子变化提供了理论依据.
