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小鼠脑微血管周细胞永生化模型的建立及其在脑血管毒物筛查中的初步应用
目的 建立小鼠脑微血管周细胞永生化模型并应用于脑血管毒物筛查研究.方法 取3周龄雄性C57BL/6小鼠2只,取小鼠大脑皮质,用组织分离和酶消化法培养原代小鼠脑微血管周细胞,逆转录病毒转染LT质粒构建永生化细胞株.采用单克隆法纯化细胞,采用细胞免疫荧光鉴定细胞纯度,MTS法绘制细胞生长曲线,将永生化小鼠脑微血管周细胞分别暴露于0、160、320、640、1280、2560 μmol/L的醋酸铅和0、5、10、20、40、80 μmol/L的氯化镉及0、5、10、20、40、80 μmol/L的亚砷酸钠24 h后,用MTS法检测细胞活力,用线性回归法计算不同毒物半数致死量(LD50).结果 永生化脑微血管周细胞呈长梭形生长,表达周细胞特异性标记物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),且都表达功能性收缩蛋白中间丝蛋白-波形蛋白(Vimentin);原代脑微血管周细胞增殖缓慢,接种第3天进入对数生长期,倍增时间为48 h;永生化脑微血管周细胞增殖旺盛,接种第3天进入对数生长期,倍增时间为24 h;永生化脑微血管周细胞生存率随各毒物染毒剂量的增加呈现下降趋势,醋酸铅LD50为2025.0 μmol/L,氯化镉LD50为36.6 μmol/L,亚砷酸钠LD50为33.2 μmol/L.结论 利用逆转录病毒转染LT质粒可成功构建永生化小鼠脑微血管周细胞,并可应用于脑血管毒物筛查研究,对永生化小鼠脑微血管周细胞的毒性大小依次为亚砷酸钠、氯化镉、醋酸铅.
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中医药防治糖尿病视网膜病变周细胞凋亡的研究进展
糖尿病视网膜病变是糖尿病患者常见的微血管并发症之一,视网膜周细胞凋亡是糖尿病视网膜病变早期的主要病理改变,近年来其机制研究进展明显.中药单味药、有效成分及复方均从多个途径如减轻高糖对视网膜周细胞的损害、抑制糖基化终末产物对周细胞的损伤、抑制视网膜微血管的炎性反应等方面发挥作用,对防治视网膜病变周细胞凋亡有着自身的优势.本文总结了近年来糖尿病视网膜病变周细胞凋亡的分子机制研究现状,并对中药在保护视网膜周细胞方面的作用进行综述,为深入的中药研究和防治糖尿病视网膜周细胞凋亡的创新药物开发提供科学依据.
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络通对不同病程糖尿病大鼠视网膜微血管细胞凋亡的影响
目的:探讨络通对不同病程糖尿病大鼠视网膜微血管细胞凋亡的影响.方法:采用链脲佐菌素65mg/kg经大鼠腹腔一次性注射制备糖尿病模型.成模糖尿病大鼠随机分成模型组、成模后即开始络通干预6个月组(络通干预组)和成模6个月后开始络通治疗3、6个月组(络通治疗1、2组).分别按期摘取眼球,制备视网膜消化铺片微血管标本,PAS染色及核苷酸末端转移酶介导dUTP缺口翻译法(TUNEL法)特异性标记凋亡细胞,光镜下观察.结果:与同期模型组比较,络通干预组视网膜毛细血管周细胞凋亡现象不明显;络通治疗1组周细胞凋亡比较常见,少数内皮细胞出现凋亡;络通治疗2组治疗6个月内皮细胞凋亡较治疗3个月时有所增多,但明显轻于12个月模型对照组.结论:络通对糖尿病大鼠视网膜微血管病变早中期的周细胞凋亡有较好的抑制作用.
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大黄(廑)虫丸对糖尿病大鼠视网膜毛细血管PI3K-AKT信号通路相关因子的影响
目的:观察大黄(廑)虫丸对糖尿病大鼠视网膜毛细血管中PI3K-AKT信号通路相关因子表达的影响,探讨大黄(廑)虫丸对糖尿病视网膜病变(DR)微血管损伤的保护作用及机制.方法:100只雄性SPF级Wistar大鼠随机分成空白组,模型组,大黄(座)虫丸低、中、高剂量组.除空白组外各组均采用链佐脲菌素腹腔注射诱导糖尿病大鼠模型.造模成功后分别于给药6、12周后取大鼠眼球进行检测.RT-PCR定量检测PI3K、AKT mRNA在视网膜组织中的表达水平.Western blot法检测各组PI3K、AKT、Caspase-9在视网膜组织中的蛋白表达量.结果:与空白组比较,模型组视网膜中PI3K、AKT mRNA表达水平下降,PI3K、AKT白相对表达量下降(P＜0.05),而Caspase-9蛋白相对表达量上升(P＜0.05);灌胃6、12周后,大黄(廑)虫丸各剂量组与模型组比较,视网膜中PI3K、AKT mRNA含量均升高,PI3K、AKT蛋白相对表达量升高(P＜0.05),Caspase-9蛋白相对表达量下降(P＜0.05),其中,大黄(廑)虫丸中剂量组PI3K、AKT mRNA表达接近空白组.结论:大黄(廑)虫丸能够上调PI3K、AKT,降低Caspase-9表达,抑制糖尿病大鼠视网膜微血管周细胞的凋亡,从而发挥其对DR微血管损伤的保护作用.
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黄总黄酮对高糖培养下牛视网膜血管周细胞凋亡的影响
目的:探讨黄芪总黄酮对高糖培养下的牛视网膜血管周细胞凋亡的影响.方法:以在体外培养3代融合的牛视网膜血管周细胞为对象,分为正常对照组、高糖组(25 mmol/L)、干预组不同浓度黄芪总黄酮组(0.25、0.5、1.0、2.0 mg/ml),孵育6d,采用TUNEL法检测培养后周细胞凋亡率;硫代巴比妥酸检测培养液丙二醛(MDA)水平;黄嘌呤氧化酶反应系统检测培养液超氧化物歧化酶(SOD)水平.结果:与高糖组比较,黄芪总黄酮0.5、1.0、2.0mg/ml组周细胞MDA含量、SOD活力、MDA含量/SOD活力比值及凋亡率均降低(P＜0.01);MDA含量/SOD活力与周细胞凋亡率二者呈正相关(r=0.921,P＜0.01);黄芪总黄酮2.0 mg/ml组周细胞氧化应激水平及凋亡率明显低于其他各组(P<0.05).结论:一定浓度黄芪总黄酮对高糖培养下的牛视网膜血管周细胞凋亡有明显的抑制作用,呈剂量依赖性.
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肾脏周细胞-肌成纤维细胞转分化的病理机制及中药的干预作用
在肾脏,周细胞(pericyte)是肾间质中肌成纤维细胞(myofibroblast,MyoF)的主要来源.周细胞-肌成纤维细胞转分化(pericyte-myofibroblast transition,PMT)是肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis,RIF)重要病理机制之一,其中,周细胞的募集、活化与分离以及周细胞源性促红细胞生成素缺乏是促进RIF形成的主要原因.在PMT启动过程中,周细胞的活化及其与微血管的分离受控于多条信号转导途径,这些信号通路包括转化生长因子-β(transforming growth factorβ,TGF-β)通路、血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)通路、血小板源性生长因子受体(platelet derived growth factor receptor,PDGFR)通路;阻断这些信号通路不仅能抑制PMT,而且,能遏制肾脏毛细血管减少,改善RIF.临床上,很多中药复方、单味中药及其提取物等都具有改善RIF的明确疗效,其中,一些中药的干预作用可能与周细胞及其PMT相关.基于此,“PMT及其药物干预的研究”将会成为中药抗脏器纤维化研究领域的重要发展方向.
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周细胞与微血管疾病及中医药研究进展
周细胞是广泛分布于全身微血管壁的结构细胞,和内皮细胞一起构成微血管和组织间隙的屏障.周细胞通过细胞连接或旁分泌信号与微血管内皮细胞对话,在调控微循环血流量、微血管通透性及血管新生等方面发挥重要作用.多种疾病的微血管病变伴随周细胞结构和功能异常,周细胞的调控成为研究热点.中医学认为微血管病变属于络脉受损,气血瘀滞于络脉导致的脏腑功能异常.中医药干预微血管病变周细胞改变取得了一些进展,如益气活血类中药对于糖尿病视网膜病变微血管周细胞具有较好的改善作用.但是,中医药在微血管病变周细胞研究中也存在着研究领域局限、研究技术和方法不精确及机制阐述深度不足等问题.该文将从周细胞的生物学特征、周细胞与微血管病变及中医药研究进展展开综述,旨为微血管病变周细胞研究及其中医药防治研究提供参考.
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周细胞在慢性肾脏病中缺氧与纤维化相互关系中的作用
肾间质纤维化、肾小管损伤和炎性细胞浸润是慢性肾脏病的重要标志.组织缺氧是肾间质损伤发生的重要机制之一.肾周毛细血管损伤导致的间质血流减少为肾间质纤维化的重要病因.纤维化时,周细胞从肾小管周围毛细血管分离并生成ECM,毛细血管稀疏介导了肾小管间质损伤、缺氧和纤维化间错综复杂的相互关系.理清上述三者之间的关系,以及周细胞在其中所起到的作用,有助于肾纤维化的治疗,延缓慢性肾脏病的进展.
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小鼠脊髓损伤后周细胞促进脊髓血管新生
目的 探讨脊髓损伤后周细胞对微血管的影响.方法 C57 BL/6小鼠随机分为:假手术组、损伤后2、7和 14 d组(S2、S7和S14),每组9只.损伤组采用改良Allen's法制作中度脊髓损伤模型.给小鼠颈静脉注入番茄凝集素(LEA),检测灌注微血管面积;用免疫荧光和免疫组化检测微血管面积和数目;用免疫荧光检测周细胞覆盖率.用缺氧条件(95％N2,5％ CO2)模拟脊髓损伤的病理条件,用基质胶系统检测内皮细胞成管.结果 与假手术组相比,S2组灌注血管面积、微血管面积和数目显著降低(P＜0.001).与S2组相比,S7组微血管数目和面积显著增高(P ＜0.05);S14组灌注血管面积、微血管数目和面积均显著增高(P＜0.05,P＜0.01),但平均值仍低于假手术组.与假手术组相比,S2和S7组周细胞覆盖率持续下降(P＜0.001).周细胞与内皮细胞共培养可显著增加缺氧条件下内皮细胞成管长度(P＜0.01).结论 脊髓损伤后周细胞可促进脊髓血管新生.
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小鼠脊髓微血管周细胞的体外培养及鉴定
目的 应用周细胞培养基(PCM)分离筛选小鼠脊髓微血管周细胞(SCMP),对其生物学功能进行评价.方法 10只3周龄C57小鼠,无菌条件下取脊髓去除软脊膜,剪碎成大约1 mm×1 mm×1 mm.两次酶消化后用含20％牛血清白蛋白的DMEM离心获得微血管.用内皮细胞培养基(ECM)培养,传代2次后改用PCM培养.倒置显微镜观察细胞增殖状况.免疫细胞化学法检测血小板源性生长因子受体β(PDGFRβ)、神经元-胶质抗原2(NG2)、von Willebrand因子(vWF)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.流式检测CD140b、CD31、CD11b和GFAP的表达.将PCM换为10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基,检测细胞α-SMA表达的变化.通过周细胞-内皮细胞共培养成管实验检测细胞成管能力.结果 接种48 h细胞爬出,7～9d汇合,周细胞和内皮细胞伴随状增殖.改用PCM培养后内皮细胞减少,周细胞呈优势生长.免疫细胞化学表明PDGFRβ和NG2阳性,vWF和GFAP阴性;流式结果表明细胞PDGFRβ的阳性率为95.52％±2.55％,GFAP为0.63％±0.26％,CD31为0.80％±0.26％,CD11b为1.02％±0.35％.10％胎牛血清的DMEM促进细胞分化,α-SMA表达升高.成管实验周细胞与内皮细胞共同形成管腔样结构.结论 通过PCM筛选法能够成功获得纯度较高的SCMP,所获得的细胞具备明显的周细胞的形态和功能特征.
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周细胞的标记分子、生理功能和相关疾病
周细胞是神经血管单元重要的组成细胞之一,在血脑屏障功能的维持和血管生成中发挥着重要的作用.另外周细胞还有收缩、免疫、迁移等功能以及干细胞潜能,能参与脑部止血和自我调节的过程.近年来,随着周细胞标记分子的发现,使得对周细胞的认识有了飞速的进展.本文根据新近研究成果,就周细胞的分布、生理功能以及周细胞相关疾病进行综述.
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周细胞的生物学特性及其在血管生成中的作用
微血管由内衬的内皮细胞和外围的周细胞组成,血管发生、血管生成和正常血管功能的维持,涉及这两种细胞的分化、增殖、迁移和共同作用等重要过程,其中对于内皮细胞已经作了大量深入的研究,但对微血管壁另一细胞组分的周细胞则并未加以重视.早在100多年前Eberth和Rouget等科学家就注意到了一种位于毛细血管周的细胞,1923年Zimmerman将之命名为周细胞(pericyte),虽然对其进行过相关研究,但长期以来明显滞后于内皮细胞,近年来周细胞在血管发育、稳定、成熟和塑型等方面的重要调控作用和意义逐步引起关注,特别是在血管生成中的作用越来越受到重视.本文主要就周细胞的细胞生物学特点和在血管生成中的作用进展进行综述.
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血管生成中周细胞相关信号通路的研究进展
周细胞(pericytes)作为一种血管外周细胞包绕在微血管壁外侧,支持血管结构的稳定.周细胞向新生血管周围募集成为新生血管成熟的标志性事件.周细胞由于参与肿瘤血管新生、糖尿病性血管病变、缺氧/缺血性血管增生等诸多病理过程而成为研究的重点.研究生理性及病理性状态下血管生成过程中周细胞相关信号转导通路,对深入理解周细胞的生物学功能及其在相关疾病中的作用有重要意义.
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血管内皮生长因子、血管生成素与缺血性脑损伤
在啮齿动物的胚胎发育过程中,脑血管的发育主要是通过血管发生(angiogenesis),而在成年人类和啮齿动物脑内,新生血管的生成则只在如低氧、缺血等病理生理条件下发生,原先存活的毛细血管经发芽或潜在吻合血管枝增大形成新血管,过程包括内皮细胞趋化移动、增殖,形成新管腔,周细胞、血管平滑肌细胞等血管周围细胞的移入、黏附至内皮层形成完整的血管壁;血管丛经重塑(修剪)形成成熟的血管系统等.
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糖尿病大鼠视网膜病变细胞凋亡的观察
目的探讨早、中、晚期不同病程糖尿病(DM)大鼠视网膜病变(DR)毛细血管周细胞、内皮细胞凋亡的发生,为研究DR发病机制提供形态学依据. 方法 90只雄性SD大鼠随机分成正常对照组(n=30)及链脲佐菌素(STZ)糖尿病大鼠6、9、12个月模型组(n=20).各实验组分别按期处死10只大鼠,取眼球作视网膜消化铺片,PAS染色及核苷酸末端转移酶介导dUTP缺口翻译法(TUNEL法)特异性标记凋亡细胞,光镜下观察. 结果 6个月模型组,TUNEL标记法显示周细胞凋亡,但未见内皮细胞凋亡.9个月模型组,PAS染色、TUNEL标记法显示周细胞、内皮细胞均有凋亡,周细胞及内皮细胞出现核固缩、核破碎、凋亡小体形成等细胞凋亡形态学改变.12个月模型组,内皮细胞凋亡多见,部分区域每个高倍视野下可见2～3个不同时期的内皮细胞凋亡. 结论 DR期间内皮细胞及细胞周细胞均可发生凋亡,DR早期以周细胞凋亡为主,中晚期内皮细胞发生凋亡,并逐渐增多.
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持续及间断高糖培养对牛视网膜血管周细胞凋亡的影响
目的 探讨不同浓度的持续高糖和间断高糖对牛视网膜血管周细胞(BRPs)增殖、凋亡及细胞周期的影响.方法 分别在低糖、持续及间断高糖下培养BRPs 7天;应用MTT比色法观察各组BRPs增殖情况;应用TUNEL法检测BRPs凋亡率;应用流式细胞术观察BRPs细胞周期的情况.结果 (1)持续及间断高糖均町抑制BRPs增殖,诱导其凋亡,与对照组比较,P<0.01,其中35mmol/L持续高糖组的吸光度为0.274,凋亡率为48.73%;(2)持续及间断高糖可使BRPs G0/G1期细胞比例增加,S期细胞比例减少,G2/M细胞比例无明显改变;(3)间断高糖组中波动幅度及频度大者对BRPs的作用更明显.结论 高糖毒性和高糖波动性共同参与视网膜病变的发生,且高糖绝对水平的作用超过高糖的不稳定性作用.
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1-(2，6-二甲基苯氧基)-2-(3，4-二甲氧基苯乙氨基)丙烷盐酸盐对肺血管周细胞增殖与免疫表型的影响
目的观察具有抗高血压作用新药1-（2，6-二甲基苯氧基）-2-（3，4-二甲氧基苯乙氨基）丙烷盐酸盐（DDPH）对低氧内皮细胞条件培养液(HECCM)诱导的大鼠肺血管周细胞(PC)增殖和免疫表型转化有无抑制作用，为开发具有降压和防止肺血管构型重建新药物提供实验依据。方法实验根据不同条件培养液分为4组：常氧内皮细胞条件培养液（NECCM）组，NECCM+DDPH组，HECCM组和HECCM+DDPH组。应用细胞培养、免疫细胞化学染色、图像分析及流式细胞术观察HECCM和DDPH对PC平滑肌肌动蛋白(α-SM-actin)和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达及细胞周期的影响。结果① HECCM组PC α-SM-actin 呈强阳性表达，CD34和S-100呈阴性反应，而其它各组PC α-SM-actin、CD34及S-100均呈阳性表达；② HECCM组PC α-SM-actin和PCNA的表达量分别是NECCM组的1.32倍(F=11.09，P=0.000 1)和1.24倍(F=2.89，P=0.025 7)，是HECCM+DDPH组的1.30倍(F=3.65，P=0.007 0)和1.21倍(F=2.63，P=0.041 4)；③HECCM组PC的G0-G1期细胞百分率分别比NECCM组和HECCM+DDPH组低11.7％和9.1％，S期细胞百分率分别高5.6％和4.2％，G2-M期细胞百分率分别高6.1％和4.9％；④DDPH对 HECCM引起的PCs合成α-SM-actin和PCNA增高的抑制率分别为23.4％和17.1％，对G0-G1期细胞进入S期增多的抑制率为8.3％。结论 HECCM促进PCs增殖并向平滑肌细胞表型转化，DDPH对此过程有抑制作用。故DDPH具有直接抑制低氧性肺血管构型重建、缓解肺动脉高压的效应。
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G蛋白信号转导调节5和血小板衍生因子受体β在慢性脑白质损伤后的表达
目的 探讨慢性脑低灌注白质损伤后脑周细胞G蛋白信号转导调节5(RGS5)和血小板衍生因子受体β(PDGFR β)的表达.方法 32只SD大鼠随机分为假手术组(S组)8只和模型组24只,模型组大鼠造模后,于慢性脑低灌注白质损伤模型第7、14、30、60天处理,依次分为A、B、C、D组.采用Western blot方法检测大鼠脑周细胞RGS5和PDGFR β表达.结果 与S组RGS5表达(1.520±0.032)比较,B组明显下降(0.490±0.054,P＜0.05),C组和D组明显升高(3.820±0.072,4.890±0.057,P＜0.01);A组和B组PDGFR β表达无明显变化(P＞0.05);C组PDGFR-β表达至高峰(3.260±0.031,P＜ 0.01);D组PDGFR β表达仍高于S组(P＜0.05).结论正常生理条件下,RGS5和PDGFR-β在脑周细胞中有一定量的表达;慢性脑低灌注白质损伤后期阶段,脑周细胞中RGS5和PDGFR-β蛋白表达增强,且PDGFR-β先于RGS5达到表达高峰,两者表达存在时相关系.
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周细胞在缺血性心脏病病理环节中的研究进展
Rouget于1873年首先发现周细胞是围绕小血管内皮细胞周围存在的一类细胞;之后在1923年由Zimmermann命名,称为周细胞,又称Rouget细胞,是微血管的壁细胞.周细胞与内皮细胞一起构成微血管和组织间隙的屏障,在调节微血管功能和稳定性方面具有重要作用[1].缺血性心脏病的发生涉及到“多元化”的机制,包括冠状动脉狭窄、冠状动脉自发性血栓形成、痉挛、炎症、微血管内皮功能异常及血管新生等[2].
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缺血性脑卒中神经血管单元的研究进展
在全球范围内,脑卒中的发生是增加国家病死率的三大疾病之一,根据发病原因,脑卒中又可分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中[1].缺血性脑卒中在中国占脑卒中患者总发病数量近70％,且呈持续上升趋势[2].缺血性脑卒中发生原因可由血栓形成,脑血管闭塞后导致血液供应中断,能量衰竭、酸中毒、兴奋性氨基酸释放、细胞内钙超载、自由基生成,终导致脑实质坏死、凋亡、自噬[3].目前虽然已有美国食品与药物管理局批准的溶栓药物组织型纤溶酶原激活剂,但其仅适用于症状发生4.5h内,易加重血脑屏障(blood brain barrier,BBB)破损,从而向出血转化,且超过时间窗的溶栓治疗还会导致再灌注损伤[4].因此,研究新的治疗靶点、治疗方法尤为重要,2003年亚裔美国科学家Lo等提出一个概念性框架—神经血管单元.其包括神经元、BBB、小胶质细胞、少突胶质细胞以及细胞外基质[5].作为神经功能的小单位,神经血管单元强调在脑卒中机制研究与靶点治疗中的整体性,不再单纯孤立的看待某一细胞靶点,同时也为之提供新的目标和思路.
