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乙肝免疫球蛋白抗体的多样性
目的 基于重链可变区的编码基因序列对乙肝免疫球蛋白(HBIG)中的IgG抗体进行分类.方法 借用文献提供的引物,以HBsAb强阳性健康个体外周血中的总RNA为模板进行RT-PCR和Nested-PCR扩增,通过将产物克隆到T载体、随机挑选测序,分析并统计出插入子的VH-D-JH-Cγ组合方式.结果 共获得56个有效克隆,全部为人VH3-D-JH-Cγ序列,可分成49种序列,其中5种序列有2或3个序列完全相同的克隆.4个Cγ功能基因也全部出现,其中IGHG2频率高(28次);23个VH3功能基因有11个出现,其中频率高的是IGHV3-23(29次);23个D功能基因有16个出现,其中频率高的是IGHD1-26(8次);6个JH功能基因则全部出现,其中频率高的是IGHJ4(33次).VH3-D-JH组合有33种,频率高的是IGHV3-23/IGHD1-26/IGHJ4(8次),其中5种与IGHG2拼接,但这5种VH3-D-JH-Cγ2序列仍有明显的差异.结论 成功地从HBsAb强阳性健康个体外周血中克隆到由VH3亚家族参与重排的IgG重链可变区序列;初步证实可变区序列不仅在VH3-D-JH-Cγ组合方式上具有极大的多样性,而且在序列上也具有明显的差异性;基于可变区测序对IgG抗体或B细胞进行分类是可行的,但需大大提高挑取克隆的数量或改用新一代大规模测序技术.
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从兔外周血直接克隆IgG重链可变区
目的 从兔外周血总RNA中直接扩增出IgG重链可变区基因.方法 先从IMGT/GENE-DB数据库中获取编码大耳白兔免疫球蛋白(Ig)重链可变区(VH)的3个胚系基因片段VH(IGHV)、D(IGHD)和JH(IGHJ),以及编码γ重链恒定区(CH)基因Cγ(IGHG)的cDNA序列,然后设计嵌套引物,以兔外周血总RNA为模板,进行RT-PCR和Nested-PCR扩增,产物经胶回收后克隆到T载体,随机挑选白色克隆测序,后将序列用Bioedit软件的Local Blast功能比对出Cγ的基因型,同时提交到IMGT/V-QUEST分析出所属的VH、D和JH胚系基因.结果 获得25个克隆的插入子序列,每个克隆均为兔IgG重链可变区的编码基因,且包含了完整的VH、D、JH胚系基因片段,以及Cγ基因第1个外显子(CH1)序列的5’端部分,但没有任何2个克隆的序列完全相同.37个IGHV功能基因出现了2个;11个IGHD功能基因出现了8个;11个IGHJ功能基因出现了4个.VH-D-JH组合方式共出现18种,即使VH-D-JH组合方式相同,序列仍具有明显的差异.结论 从兔外周血总RNA中直接扩增出了IgG重链可变区,自行设计的引物显示出了高度的特异性和良好的兼并性.
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滤泡型淋巴瘤中t(14;18)染色体易位的分析及其临床意义
目的 探讨滤泡型淋巴瘤(FL)的分子遗传学特征及其在病理诊断中的意义.方法 收集55例FL石蜡标本,对照组小B细胞淋巴瘤28例和反应性滤泡增生(RFH)10例,应用套式PCR技术检测FL中,免疫球蛋白重链基因(IgH)的克隆性重排;应用标准PCR技术检测55例FL中t(14;18)易位,以10例RFH做对照;采用双色荧光原位杂交(FISH)技术检测20例淋巴结FL中t(14;18)易位,以4例RFH作为对照;并与PCR检测结果进行比较.结果 (1)55例FL中,结内49例,结外6例.男性33例,女性22例,男女比为1.5∶1.发病年龄36～79岁(中位年龄57岁);FL分级:FL1～3分别为25例、19例和11例.(2)55例中50例(90%)检出β-肌动蛋白(actin),该50例中FR3A阳性24例(48%),FR2阳性25例(50%),其中15例(30%)呈FR3A和FR2双阳性,共34例(68%)IgH基因重排.对照组小B细胞淋巴瘤28例中,25例检出β-actin,其中FR3A阳性18例(64%),FR2阳性17例(61%),共24例(86%)可检测出克隆性IgH基因重排.4例RFH均未检出IgH基因重排.(3)在44例结内FL中检出15例(34%)t(14;18)易位,其中14例在MBR,1例在mcr.(4)20例中,有16例(80%)可检出t(14;18)易位.结论 (1)IgH克隆性重排在FL中的检测率比其他小B淋巴细胞低.(2)FISH检测石蜡包埋组织中t(14;18)易位有助于FL的诊断.FISH比PCR的敏感性更好,操作简便,可用于检测石蜡包埋组织中的分子遗传学改变.
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经典型Richter综合征转化前后IgVH基因克隆重排及突变分析
目的 检测经典型Richter综合征的IgVH基因克隆重排及突变状态,分析转化前后IgVH基因的分子特征及其与预后的关系,并对可能涉及的分子机制进行初步探讨.方法 用基因扫描和测序分析IgVH基因.另外用免疫组织化学LAB-SA法检测两种肿瘤中zeta链结合蛋白激酶70(ZAP70)、p53、干扰紊调节因子(IRF)-4等可能潜在危险因子的表达,并结合随访资料进行生存率分析,筛选危险因子.结果 (1)B-CLL/DLBCL克隆相关(18/23,78.3%),克隆不相关(5/23,21.7%);(2)在16例克隆相关中,12例转化前B-CLL及转化后DLBCL携带未突变IgVH基因;(3)转化前后IgVH基因使用是非随机的,在克隆相关的病例中,B-CLL/DLBCL常使用VH3-23、VH3-74、VH1-2,各占11.1%;(4)转化后DLBCL仅部分表达CD5(32.1%)和CD23(14.3%)及ZAP70(23.8%),绝大多数表达p53(80.6%)和IRF-4(82.6%);(5)17例转化后DLBCL患者中位生存时间为7个月;(6)统计学分析生存时间与B-CLl/DLBCL转化前后克隆相关与否、IgVH基因的突变状态、ZAP70、p53、IRF-4的表达不相关.结论 (1)转化后DLBCL中克隆相关与克隆不相关的比例为2:1;(2)克隆相关的DLBCL多由携带未突变型IgVH基因的B-CLL患者转化而来;(3)发生转化的B-CLL中IgVH基因使用的偏向性提示了抗原在转化中的可能作用;(4)转化后DLBCL与普通DLBCL在IgVH基因的使用、突变状态,免疫表型及预后的不同,提示其可能是一种新的DLBCL亚类.
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人源抗狂犬病毒基因工程单链抗体的研究
目的 研制人源抗狂犬病毒基因工程抗体.方法 从具有高滴度狂犬病毒抗体的疫苗接种者采集外周血淋巴细胞,通过pHAL14载体和高效噬菌体系统构建人源抗狂犬病毒单链基因工程抗体库,经纯化的狂犬病毒aG株富集筛选,通过ELISA和IFA鉴定阳性抗体克隆并进行序列测定.利用IgG表达载体VH/VK双质粒系统瞬时转染293T细胞实现IgG抗体的分泌型表达,通过亲和力测定和中和试验鉴定IgG抗体功能.结果 成功地获得了6株抗狂犬病毒糖蛋白的人源单克隆抗体,非竞争ELISA显示6株抗体具有较高的亲和力,体外中和试验证实这6株人源单抗对狂犬病毒CVS株无中和活性,对aG株具有较强的中和活性.结论 从免疫库中获得了6株人源单克隆抗体,为狂犬病毒的鉴别诊断和治疗奠定了基础.
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人源抗EV71病毒基因工程抗体的研究
目的 研制人源抗EV71病毒基因工程抗体.方法 采集多个患儿外周血淋巴细胞,构建人源抗EV71单链(scFv)噬菌体抗体基因文库.用纯化的EV71 VPI蛋白对抗体库进行筛选,将筛出抗体的轻链和重链通过序列测定确定抗体轻重链型别后分别克隆入全抗体表达载体pAC-LCH3R后转染昆虫Sf9细胞,利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现全抗体的分泌型表达.结果 成功地获得了1株抗EV71病毒VPI蛋白的人源单克隆抗体,利用ELISA、IFA对所获人源单克隆抗体的功能特性进行鉴定,表达成分泌型IgG全抗体在体外与A型及C4亚型EV71病毒的中和反应结果 显示为阴性.结论 从免疫库中获得了1株人源非中和单抗,为EV71病毒引起的手足口病的鉴别诊断奠定了基础.
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免疫固定电泳在多发性骨髓瘤中的应用
目的 探讨免疫固定电泳技术(IFE)在鉴定多发性骨髓瘤诊断中的应用.方法 采用免疫固定电泳技术检测50例多发性骨髓瘤患者血清标本.结果 其中45例多发性骨髓瘤检出M蛋白,M蛋白分型为IgGκ型16例,IgGλ型13例,IgAκ型6例,IgAλ型10例,单纯λ型2例;3例未检出M带.结论 采用免疫固定电泳技术诊断多发性骨髓瘤,沉淀带易识别,操作简单、快速.对鉴定各类型M蛋白有重要价值.
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新型内源性磁共振报告基因——小鼠铁蛋白基因的构建
pcDNA3.1(-)-Fth成功构建,符合酶切和测序鉴定结果.结论 初步构建的小鼠铁蛋白重链质粒,为进一步探讨铁蛋白基因作为一种新型内源性磁共振分子影像报告基因在细胞示综和基因显像中的应用奠定了基础.
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Annexin A2与乳腺癌关系的研究进展
Ammexin A2又名P36、P39、Annexin Ⅱ、Calpactin Ⅰ重链、Lipoeortin Ⅱ,是Annexin蛋白(磷脂结合蛋白)家族13个成员中的一员,存在于人内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞、神经细胞和一些肿瘤细胞,在增生和转化的细胞中高表达,在终末分化的细胞中低表达,早在急性早幼粒细胞白血病中发现Annexin A2高表达.近年来,Annexin A2越来越多的生物学效应被揭示,Annexin A2与其他Annexins不同,具有与RNA结合的特性,与DNA合成、复制相关,在肿瘤的发生、浸润和转移中起作用[1-2].
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儿童急性淋巴细胞白血病IgH基因重排的定量检测研究
目的 建立免疫球蛋白重链(IgH)的实时定量(RQ)-PCR检测体系,以用于儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)微小残留病(MRD)检测.方法 采用定性PCR筛选109例儿童B细胞ALL(B-ALL)IgH基因单克隆重排,根据连接区序列设计等位基因特异性引物,应用RQ-PCR技术,采用胚系Taqman探针与引物,在41例患儿中建立RQ-PCR定量检测方法,并分析其敏感度、特异性等.结果 109例儿童B-ALL初诊标本中IgH单克隆重排有48例,经测序分析发现,V、D、J片段频率高的分别为V3家族、D3家族和J4家族.RQ-PCR方法扩增48例IgH单克隆重排的初诊DNA,其中41例可重复敏感度和大敏感度均≤10-4,非特异性扩增的循环阈值(Ct值)均＞40,与特异性扩增Ct值的差距均＞3.标准曲线斜率均值为-3.31±0.19,截距均值为37.66±1.23,相关系数均为0.97以上.结论 以IgH基因重排为靶分子,采用RQ-PCR方法和胚系探针策略检测儿童B-ALL,敏感性≤10-4,并具有较高的特异性,适于MRD的定量研究.
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膀胱出口梗阻引起逼尿肌肌球蛋白重链亚型表达改变的实验研究
目的检测膀胱出口梗阻(BOO)后逼尿肌肌球蛋白重链亚型表达改变.方法雄性新西兰白兔14只,分为梗阻组和对照组,每组7只.梗阻组行手术部分结扎膀胱颈部,制成BOO动物模型.5周后两组均切除膀胱并测定膀胱重量、容量,提取逼尿肌组织蛋白,行聚丙稀酰胺凝胶电泳,蛋白印迹法检测平滑肌肌球蛋白重链亚型(SM1和SM2)表达的改变;提取逼尿肌组织mRNA行RT-PCR反应检测平滑肌肌球蛋白重链亚型SM1和SM2 mRNA表达的改变.结果梗阻组和对照组膀胱重量分别为(13.8±4.4)g和(3.7±0.5)g,P＜0.01;两组膀胱容量分别为(70.4±18.9)ml和(109.0±29.0)ml,P＜0.05.梗阻组肌球蛋白重链亚型SM2:SM1为1.2:1.0,SM2 mRNA:SM1 mRNA为1:1.对照组分别为3:1和3:1. 结论逼尿肌肌球蛋白重链亚型SM1、SM2的表达与逼尿肌的功能状态密切相关,随着SM1、SM2比例的改变,肌肉收缩功能亦发生相应变化.
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实时定量聚合酶链反应检测微小残留白血病的临床研究
目的探讨并研究实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)技术定量检测小儿急性淋巴细胞白血病(ALL)微小残留病(MRD)的临床适用性和临床价值.方法以免疫球蛋白重链(IgH)基因重排作为ALL的肿瘤标志,应用RQ-PCR、胚系探针策略,定量检测了34例B细胞ALL(B-ALL)患儿的MRD,并对其中的16例患儿进行了缓解期MRD的定量动态追踪观察.结果在34例B-ALL患儿的初治标本中IgH基因单克隆重排16例,对16例单克隆IgH重排靶基因进行序列分析发现,V片段使用频繁的是V3家族,J片段使用频繁的是J4和J6.在16个靶基因中,RQ-PCR的检测敏感度有9例为10-4,6例为10-5,1例为10-3,非特异性扩增见于6例患儿.16例初治患儿的标准曲线相关系数均为0.99以上,斜率均值为-3.34±0.37,截距均值为24.30±2.95.对16例患儿随访期样本的MRD动态追踪研究发现,复发患儿的MRD水平较高且复发前有动态增加.诱导化疗结束时的MRD水平与ALL高危因素无明显相关性(P＞0.05).结论研究表明,RQ-PCR技术胚系探针策略检测ALL患儿的MRD具有临床适用性,随访期标本MRD的定量检测及动态追踪监测具有临床价值.
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基因重排检测在原发性鼻腔非霍奇金淋巴瘤诊断和分型中的应用
目的 探讨免疫球蛋白重链(immunoglobulin heavy chain, IgH)和T细胞受体(T-cell receptor, TCR)基因重排在鼻腔非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma, NHL)诊断和分型中的价值.方法 采用两对引物进行半巢式聚合酶链反应(polymerse chain reaction, PCR)检测11例B细胞淋巴瘤组织DNA的单克隆性IgH基因重排;采用两对引物进行一步法PCR 检测23例NK/T细胞淋巴瘤和20例T细胞淋巴瘤组织DNA的单克隆性TCR基因重排.以10例鼻息肉组织标本作为对照.结果 11例B细胞淋巴瘤中IgH基因单克隆性重排10例阳性(90.9%),20例T细胞淋巴瘤中 TCR基因单克隆性重排17例阳性(85.0%),23例NK/T细胞淋巴瘤中TCR基因单克隆性重排10例阳性(43.5%). 10例鼻息肉标本采用相应引物扩增结果均为阴性.结论 在鼻腔NHL中,基因重排检测是一种有效的辅助诊断和分型方法,采用两对引物进行PCR可提高基因重排检测的阳性率.
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免疫球蛋白重链基因重排及bcl-2/JH融合基因检测眼眶淋巴细胞增生性疾病
目的探讨检测免疫球蛋白重链(immunoglobulins heavy-chain, IgH)基因重排及bcl-2/JH融合基因在眼眶淋巴细胞增生性疾病诊断中的意义.方法对1994年1月至1999年12月我院通过手术或活检取得的48例眼眶淋巴细胞增生性疾病患者眼眶组织的石蜡标本行光镜、免疫组织化学检查及聚合酶链反应(PCR)扩增IgH可变区第三框架区(third frame work region,FR3)基因重排及bcl-2/JH融合基因检测分析.结果 FR3重排的PCR扩增显示22例标本为淋巴细胞单克隆增生.恶性淋巴瘤、良性反应性淋巴细胞增生及淋巴细胞性炎性假瘤的阳性率分别为75.0%、40.0%及16.7%.bcl-2/JH融合基因的PCR扩增示恶性淋巴瘤的阳性率为30.0%,良性反应性淋巴细胞增生及淋巴细胞性炎性假瘤患者检查结果均为阴性.结论 PCR扩增的FR3基因重排检测对诊断眼眶淋巴细胞增生性疾病有重要价值;bcl-2/JH融合基因检测阳性率偏低,不宜用于临床.
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抗A型肉毒毒素鼠源性单克隆抗体的制备和鉴定
目的：制备与鉴定抗A型肉毒神经毒素重链C端（ heavy chain of botulinum neurotoxin serotype A， BoNT／AHc）特异性鼠单克隆抗体。方法通过纯化BoNT／AHc抗原、免疫BALB／c小鼠并建立杂交瘤细胞以制备鼠单抗，用ELISA、Western印迹实验和抗体分型试剂盒进行分析鉴定，并通过ELISA检测鼠单抗与BoNT／AHc突变体结合，初步鉴定其在BoNT／AHc的结合表位。结果得到纯度较高的BoNT／AHc抗原，制备了4株特异性鼠单抗1A4、3H3、3H7、5H8。间接ELISA结果显示，单抗细胞上清效价均＞3．0×103；Western印迹检测结果显示，单抗均能与BoNT／AHc特异性结合；抗体亚型鉴定结果为1A4、3H7属于IgG1（Κ），3H3属于IgM（Κ），而5H8属于IgG2b （Κ）；叠加ELISA实验表明，4株单抗抗原识别表位相近；用ELISA检测单抗与BoNT／AHc突变体结合实验结果初步确定了4株单抗与BoNT／AHc的结合表位。结论对抗A型肉毒毒素鼠源性抗体完成了制备和鉴定，为肉毒毒素中和抗体的开发与阐明中和抗体的表位奠定了基础。
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血清免疫球蛋白测定
B-淋巴细胞受抗原刺激后,引起一系列细胞形态与生化特性变化,转化为淋巴母细胞并增生繁殖,后演化为浆细胞,合成免疫球蛋白.免疫球蛋白普遍存在于生物体的血液、体液、外分泌液及某些细胞(如淋巴细胞)的细胞膜上.免疫球蛋白是一组具有抗体特性的球蛋白,其分子量很大,含有1000个以上的氨基酸分子,均由其共同抗原的两个相同的轻链(L链)和具有特异性抗原的两个不同的重链(H链)组成.
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骨髓瘤细胞系KM3中免疫球蛋白重链基因易位的初步研究
目的研究骨髓瘤细胞系KM3中免疫球蛋白重链基因(IgH)的易位.方法用PCR方法合成地高辛标记的各IgH转换区(switch region,S区)探针,即σμ/σδ、Sμ、Sγ、Sα、Sε的3′端和5′端探针,应用Southern blot方法检测杂交结果.结果胎盘基因组DNA中有一10.0 kb 的Hind Ⅲ片段可同时与5′Sμ探针和3′Sμ探针杂交,而骨髓瘤细胞系KM3基因组DNA中除有一相同的10.0 kb的Hind Ⅲ片段外,还有1个5.6 kb的Hind Ⅲ片段,仅与3′Sμ探针杂交.结论骨髓瘤细胞系KM3存在1个由IgH基因易位引起的异常重组片段,且IgH易位的断裂点在Sμ区.
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非霍奇金淋巴瘤患者血浆游离DNA IgH和TCRγ基因重排的检测及临床意义
目的 检测非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者外周血血浆游离DNA免疫球蛋白重链(IgH)基因和T细胞受体γ(TCRγ)基因克隆性重排并探讨其临床意义.方法 提取74例NHL患者血浆游离DNA并以Globin基因确定其存在,通过PCR方法 检测IgH(FR3A/VLJH)和TCRγ(TVG/TJX)克隆性基因重排,并分别与外周血单个核细胞DNA、病理组织学检查进行比较.结果 74例患者中有58例(35例B-NHL和23例T-NHL)初诊、难治或复发的患者血浆游离DNA提取成功,另16例临床缓解患者未提取出血浆游离DNA.35例确诊的B-NHL患者中IgH基因单克隆重排阳性31例(88.6%),无一例出现TCRγ基因单克隆重排,23例确诊的T-NHL患者中TCRγ基因单克隆重排阳性8例(34.8%),其中2例同时出现IgH基因单克隆重排.在50例同时获得病理活检标本基因重排结果 的病例中,30例B-NHL患者血浆DNA IgH基因重排阳性26例(86.7%),病理活检标本阳性24例(80.0%)(P＞0.05);20例T-NHL患者血浆DNA TCRγ基因重排阳性7例(35%),病理活检标本阳性6例(30%)(P＞0.05).结论 NHL患者血浆中可以检测出肿瘤源性的血浆游离DNA;NHL患者血浆游离DNA IgH、TCRγ基因重排的检测简单、方便、相对无创,与病理活检标本的检测具有相同的临床意义.
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单灶透明血管型Castleman's病病理细胞起源研究
目的从基因水平了解6例Castleman's病(CD)病理细胞组成特点.方法肿物切除以后,苏木精-伊红染色作常规组织病理检查以明确肿物的组织学类型;应用免疫组化法研究细胞表型,明确肿物的细胞组成;根据细胞组成,应用R-PCR和克隆测序方法了解肿物主要细胞克隆组成.结果6例患者皆为限局性透明血管型CD;肿瘤组织滤泡样结构中主要为B淋巴细胞,滤泡间隙为T淋巴细胞.RT-PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后得到单一条带,RT-PCR产物克隆测序得到128 bp、122 bp两种碱基长度的克隆,相同长度序列间具有高度一致性,克隆内分别存在12个和7个碱基的差异.结论6例患者肿瘤组织中含有单/寡克隆瘤性B细胞,这些B细胞起源于生发中心细胞.
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间α胰蛋白酶抑制剂重链H4在上皮性卵巢癌组织中的表达及意义
本实验采用Western-blot和免疫组织化学的方法检测卵巢上皮性肿瘤中ITI-H4完整蛋白的表达情况,同时结合临床病理资料进行分析,以期发现卵巢上皮性肿瘤的特异性组织癌变相关的血清蛋白质.
