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鼻疽诺卡菌菌体蛋白的免疫蛋白质组学研究
目的 通过鉴别鼻疽诺卡菌菌体蛋白中具有免疫原性的蛋白,为筛选鼻疽诺卡菌特异诊断抗原提供线索.方法提取鼻疽诺卡菌菌体蛋白进行双向电泳,结合免疫印迹法筛选与抗鼻疽诺卡菌兔血清发生免疫反应的蛋白点.结果 在鼻疽诺卡菌菌体蛋白的免疫杂交膜上,共发现9个具有抗原活性的蛋白,其中8个可在考马斯蓝染色胶上找到匹配点,通过介质辅助激光解吸电离飞行时间质谱成功鉴定8个蛋白,全部定位于胞内.结论 本研究成功建立鼻疽诺卡菌免疫蛋白质组学方法,在鼻疽诺卡菌菌体蛋白中发现新的具有免疫原性的蛋白,可作为鼻疽诺卡菌特异性诊断候选抗原,用于诊断试剂的研究.
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噬菌体随机肽库技术及其在寄生虫学领域的应用
1985年Smith率先将EcoRI内切酶的部分基因片段插入丝状噬菌体fl的外壳蛋白基因Ⅲ区,使目的基因编码的多肽呈现在噬菌体表面,并建立了噬菌体表面呈现技术(Phage display techniques).在此基础上,1990年Scott首次将编码随机序列肽的DNA与丝状噬菌体外壳蛋白基因Ⅲ整合,使随机肽与噬菌体蛋白以融合形式表达,并呈现在噬菌体表面,从而建立了噬菌体随机肽库技术(Phage display random peptide libraries).近年来,噬菌体随机肽库已成为探索受体与配体之间相互作用结合位点、寻求高亲和力生物活性的配体分子、探测未知蛋白空间结构表位的有利工具,在抗原表位(抗原决定簇)定位和模拟蛋白相互作用位点定位、功能配体或药物的筛选、新型疫苗的研制以及肿瘤治疗上拓宽了研究者的思维,提供了新的途径.目前,该技术在寄生虫学领域同样受到研究者的青睐.本文就噬菌体随机肽库技术及其在寄生虫学领域中的应用作一综述.
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实时荧光定量PCR技术检测结核分枝杆菌方法的建立与初步应用
结核分枝杆菌不产外毒素和侵袭性酶,而结核分枝杆菌分泌的蛋白及菌体蛋白在宿主抗结核分枝杆菌的细胞免疫和体液免疫应答中发挥着重要作用.结核分枝杆菌mRNA的半衰期很短(3~5 min),是结核分枝杆菌活菌诊断及检测药物敏感性很好的分子标志.因此通过检测临床上分离的结核分枝杆菌的mRNA可以快速判断是否为致病性结核杆菌及结核分枝杆菌是否为活菌.
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空肠弯曲菌鞭毛蛋白FlaA的原核表达
空肠弯曲菌(CJ)为常见的人兽共患病原菌,实验表明,CJ的菌体蛋白和LPS抗原均在引起自身免疫反应的神经性疾患的发生过程中具有重要意义.CJ的鞭毛抗原亦有可能参与某些神经性疾患的病理作用导致机体损伤.
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革新传统紫外线灯支架的技术
紫外线是一种低能量的电磁辐射,照射时使细菌体蛋白光解和变性,故常用于手术室、治疗室、注射室等地方的空气消毒.照射方法有直射和散射,安装形式为悬吊式,其距离为1~2.5 m内.一般层高3 m以内、10~15 m2的室内面积需安装30W紫外线光管1支,因紫外线穿透力很差,一张纸、一层布能阻挡其穿透力,空气中的尘埃也影响其穿透力.因此,根据2000年5月中华人民共和国卫生部颁发的<消毒技术规范>和中华人民共和国国家标准G.B15982-1995<医院消毒卫生标准>的要求紫外线灯管和支架应定期用95%的酒精擦拭,以期达到消毒规范要求.
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抗人大肠癌单链抗体-胞嘧啶脱氨酶融合基因的构建及表达
目的:构建抗人大肠癌重组单链抗体ND-lscFv与酵母胞嘧啶脱氨酶CD的融合基因,并在大肠杆菌中表达.方法:采用基因重组技术借助GSGGSG Linker序列将酵母胞嘧啶脱氨酶基因融合于ND-lscFv基因的3'端,构建pET-28a(+)ND-lscFv-CD载体,转化E.coli BL21,经IPTG诱导,表达二者的融合蛋白.表达产物用Ni-NTAresin亲和层析方法纯化,并采用ELISA检测其免疫活性,MTF法测定由ND-lscFv-CD/5FC构成的ADEPT系统对大肠癌细胞的体外杀伤作用.结果:序列测定表明:ND-lscFv-CD基因全长l 269 bp,包含了732 bp的scFv基因和477 bp的CD基因.SDS-PAGE检测显示,融合蛋白相对分子质量47 KDa,与预测值一致.光密度扫描结果表明,重组蛋白占菌体蛋白总量的27%,ELISA检测证实,ND-lscFv-CD保留了与ND-1scFv相近的免疫活性.MTT实验检测结果显示,由scFv-CD/5FC构成的ADEPT体系对大肠癌细胞具靶向杀伤作用.结论:成功地构建了抗人大肠癌单链抗体ND-lscFv与酵母胞嘧啶脱氨酶CD的融合蛋白,并在大肠杆菌中高效表达.融合蛋白具有良好的免疫活性和一定的酶活性.
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E-coli和Yeast菌体蛋白ELISA定量测定方法的建立
目的:提高酶联免疫吸附测定(ELISA)方法的灵敏度.方法:将聚苯乙烯微孔板(PS)经过紫外线(UV)辐照后,用葡萄球菌A蛋白(SPA)预包被,再应用生物素-链霉亲和素(BSA)反应建立双抗体夹心ELISA.结果:检测低限为1.95 ng/ml,方法的批内变异分别为7.96%和8.63%.结论:为菌体蛋白的测定提供了一种新的方法.
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应用ELISA测定重组细胞因子中残余大肠杆菌菌体蛋白含量
目的建立灵敏度高,重复性好的残余宿主菌E.coli菌体蛋白含量的测定方法.方法电泳显示5株大肠杆菌DH52、JM103、JM105、N8430和HB101的蛋白质组分各不相同,但均可被免疫印迹显色,说明免抗E.coli.K12,C600抗体包括了其主要菌体蛋白的抗体,因此,用ELISA检测相应的菌体蛋白含量.结果优化后的ELISA对DHa、JM103、JM105和HB101检测灵敏度均达到10ng/ml.用混合菌体蛋白作为E.coli菌体蛋白通用标准,其灵敏度达到7.8ng/ml,含量在7.8~250ng/ml范围内,一次方程(y=a+bx)线性良好(r>0.990);在7.8~1 000ng/ml范围内,二次方程(y=a+bx+c2)线性良好(r>0.990).变异系数小于14%(n=4).应用该法对国内外重组产品进行测定,发现不同厂家不同产品其菌体蛋白含量各不相同.8种细胞因子共57批,菌体蛋白含量大于1%的3批,占5.3%;大于0.1%的9批,占15.8%;大于0.01%的28批占49.1%.说明还有不少厂家其重组产品纯化工艺有待进一步提高.结论本方法灵敏度高,重复性好,可用于重组产品中大肠杆菌残余菌体蛋白的测定.
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异烟肼耐药和敏感结核分枝杆菌的比较蛋白质组织学研究(摘要)
目的研究结核分枝杆菌异烟肼耐药菌株与敏感菌株的蛋白质表达差异,鉴定结核分枝杆菌中与异烟肼耐药相关的菌体蛋白.方法应用双向电泳技术比较2株异烟肼耐药菌株与2株敏感菌株的全菌蛋白表达图谱差异,发现异烟肼耐药结核分枝杆菌表达量显著增加26个蛋白质斑点,通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪进行质谱分析,获得6个明确的肽质量指纹谱,通过蛋白质数据库进行检索分析.结果6个蛋白分别为海藻糖磷酸酶、铁钼蛋白A、莽草酸5脱氢酶、葡萄糖胺果糖6磷酸氨基转移酶、吲哚3甘油磷酸合成酶、TetR家族转录词控因子.结论上述蛋白的鉴定将对发现新型抗结核药物靶位和异烟肼耐药结核病诊断的分子标志物可能有所裨益.
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用侵袭性曲霉病患者血清筛选特异性反应的烟曲霉蛋白质
目的 用对烟曲霉蛋白质反应阳性的侵袭性曲霉病(IA)患者血清筛选免疫反应性强的烟曲霉蛋白质用于免疫蛋白质组分析.方法 TCA/丙酮沉淀法制备烟曲霉分泌蛋白及菌体蛋白质作为包被抗原,用ELISA法筛选确诊IA患者血清,反应阳性的血清进一步与烟曲霉分泌蛋白及菌体蛋白质进行免疫印迹,筛选免疫反应强的蛋白质.结果 11例确诊的LA患者中,6例血清抗体阳性.用此血清进行免疫印迹分析显示,烟曲霉分泌蛋白质的免疫反应性在反应强度及反应数量上均优于菌体蛋白质.在4种不同培养基的分泌蛋白中,YEPG分泌蛋白的免疫反应性强,有免疫反应的蛋白条带数量多.结论 用 YEPG培养烟曲霉14 d的分泌蛋白质免疫反应性强,且免疫反应条带多,拟用于免疫蛋白质组学分析,进一步筛选特异性烟曲霉抗原.
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应用ELISA法检测门冬酰胺酶中残余大肠杆菌菌体蛋白含量的研究
采用Cygnus公司“大肠杆菌菌体残留蛋白检测试剂盒”检测门冬酰胺酶中残余宿主菌菌体蛋白含量,建立门冬酰胺酶中宿主菌菌体蛋白残留检测方法并进行了相关方法验证.验证结果表明:宿主菌菌体蛋白浓度在0~ 100 ng/mL范围内呈良好的线性关系,线性相关系数大于0.99,不同实验人员测得的精密度RSD均小于5%,平均回收率为94.34%.通过对8批门冬酰胺酶样品的检测,测得门冬酰胺酶中的残余宿主菌体蛋白含量均小于550×10-6.该方法具有快速,操作安全简便等优点,灵敏度高,重现性好,可用于门冬酰胺酶的宿主菌体蛋白的残留检测.
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重组水蛭素Ⅲ的质量控制标准研究
通过测定重组水蛭素Ⅲ的质粒中目的基因序列、重组水蛭素Ⅲ分子质量、C末端序列以及菌体蛋白和DNA残留量,对重组水蛭素Ⅲ的质量进行研究.结果:重组质粒经Nhe Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切和基因序列测定,表明工程菌所携带的质粒上含有完整的信号肽基因、Nhe Ⅰ酶切位点、水蛭素HV3基因和HindⅢ酶切位点;还原性SDS-PAGE结果表明在14 000 u处有单一条带,为重组水蛭素Ⅲ二聚体;测定样品分子C端序列为E-D-Y-A-D-E-P-I-P-E-F,与重组水蛭素Ⅲ的理论值一致;重组水蛭素Ⅲ样品中的残留菌体蛋白和DNA含量分别是0.02%和每剂量样品中残留DNA含量低于2.8 ng.结论:从基因水平、蛋白水平和杂质的角度证明重组水蛭素Ⅲ产品符合质量控制标准.
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恙虫病立克次体蛋白抗原及其编码基因研究进展
恙虫病立克次体(Rickettsia tsutsugamushi)是恙虫病(Scrub typhus)的病原体,专性活细胞内寄生,革兰氏阴性,恙螨是其传播媒介。在分类地位上,恙虫病立克次体原属于立克次体科立克次体属,但由于其在许多生物学和遗传特性方面不同与其他立克次体,1995年将其另立一属一东方体属(Orientia),称为恙虫病东方体(Orientiatsutsugamushi)[1]。近十多年来,新的技术方法尤其分子生物学方法不断引入恙虫病立克次体的研究,使病原学研究更加系统深入广泛。现对其蛋白抗原与其编码基因的研究综述如下。1 恙虫病立克次体的多肽组成 纯化的恙虫病立克次体裂解物或蛋白抗原或多肽经SDS-PAGE电泳,发现有30多条带[2]。其中主要的多肽为56kD,58kD,47kD,70kD。由于各实验室实验条件的不一致,使得恙虫病立克次体多肽的命名也较为混乱,同一多肽有不同的名称。例如58kD(Hanson称为63kD,Tamura称其为60kD),56kD(Hanson称为60kD),47kD(Hanson称为50kD)。恙虫病立克次体各株SDS-PAGE电泳图谱是相似的,但某些多肽的分子量有细微的差别。如Kato株56kD多肽比其他株47kD(Gilliam,Karp,Shimokoshi)的分子量大。这与Melinda F.Moree等的发现是一致的[3](见表1)。菌体蛋白的迁移还受温度,2-巯基乙醇等样品制备条件的影响[4,3]。同一多肽分子,不同制备条件下会以不同的状态存在(见表2)。由表2可见,56kD蛋白是一个热修饰蛋白,其存在状态依温度不同而异。
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不宜与红霉素同用的药物
红霉素在临床上应用十分广泛,且价格便宜,颇受医生和患者的青睐,但应注意红霉素不宜与下列药物同时应用.青霉素因红霉素能快速抑制菌体蛋白的合成,促使细菌于静止状态,而青霉素类属于繁殖期杀菌剂,故上述两种药物伍用会产生拮抗作用.
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浅谈几种输液反应的防治方法
输液反应可分为发热反应、肺水肿、静脉炎、空气栓塞等.针对常见的输液反应及症状,谈谈几种防治方法,可以有效的防止输液反应.1发热反应原因发热是常见的输液反应,常因输入致热物质(致热原、死菌、游离的菌体蛋白或药物成分不纯)、输液瓶清洁消毒不完善或再次被污染;输入液体消毒、保管不善变质,输液管表层附着硫化物等所致.
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临床输液反应的预防
在我国,静脉给药是临床普遍的治疗方法,也是抢救治疗病人中必不可少的途径之一.而输液反应是临床输液过程中经常遇到的问题,常因输入致热物质(包括致热原、死菌、游离菌体蛋白,其它蛋白质和非蛋白质的有机或无机物质)而引起,临床表现为发冷、寒战和发热,轻者发热常在38℃左右,于停止输液数小时内体温可恢复正常.严重者,初起寒战,继之高热达40℃~41℃,并有恶心、呕吐、头痛、脉速等症状,不但给病人带来不应有的痛苦,还给病人添加了经济负担.诱发临床输液反应的原因较多,现就导致输液反应的常见原因及其预防做以下探讨.
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输液反应及预防
1发热反应
1.1原因发热是常见的输液反应,常因输入致热物质(致热原、死菌、游离的菌体蛋白或药物成分不纯)、输液瓶清洁消毒不完善或再次被污染;输入液体消毒、保管不善变质;输液管表层附着硫化物等所致。
1.2症状主要表现发冷、寒战、发热(轻者发热常在38℃左右,严重者高热达40-41℃),并伴有恶心、呕吐、头痛、脉快、周身不适等症状。