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超声微泡连接特异性抗体的制备方法及靶向化处理因素对超声微泡物理性质的影响
目的 探讨超声微泡连接特异性抗体的制备方法及靶向化处理因素对超声微泡物理性质的影响.方法 应用生物素-链霉亲和素连接系统,使注射用六氟化硫微泡(SonoVue)与特异性抗血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)抗体相连接,用间接免疫荧光法检测抗体与微泡的连接,用马尔文激光粒径分析仪分别测定生物素化处理前后微泡的粒径,采用超声诊断仪评价微泡靶向化构建前后的显像效果.结果 SonoVue与特异性抗体成功连接,间接免疫荧光检测呈阳性.生物素修饰后的微泡粒径分布变窄,与普通微泡的超声显像效果略有差异.结论 通过生物素-链霉亲和素系统可以成功靶向化构建超声微泡,靶向化处理因素对微泡的粒径有一定影响,对微泡的超声显影效果略有影响.
关键词： 造影剂 微泡 生物素-链霉亲和素 血管细胞间黏附分子-1 靶向化构建 -
应用生物素-链霉亲和素酶联免疫吸附法检测原发性肝癌特异性γ-谷氨酰转移酶
目的 观察生物素-链霉亲和素酶联免疫吸附(ELISA)法检测原发性肝癌(PHC)特异性欧曼陀罗凝集素强结合的γ-谷氨酰转移酶(DSA-GGT)的临床应用价值.方法 对45例正常对照者、58例PHC患者和203例非PHC患者(包括其他肿瘤患者36例,肝良性病变患者167例),应用生物素-链霉亲和素ELISA法检测受试者血清中DSA-GGT的水平,同时用ELISA法检测受试者血清中甲胎蛋白(Are)的水平.结果 58例PHC患者中,DSA-GGT阳性38例,检测DSA-GGT诊断PHC的灵敏度为65.5%;203例非PHC患者中,DSA-GGT阳性18例,检测DSA-GGT诊断PHC的特异度为91.1%.该方法的平均批内及批间变异分别为8.9%和11.5%.58例PHC患者中,AFP阳性40例,检测AFP诊断PHC的灵敏度为69.0%;203例非PHC患者中,AFP阳性19例,检测AFP诊断PHC的特异度为90.6%.DSA-GGT与AFP联合检测诊断PHC的灵敏度和特异度分别为93.1%和85.7%.结论 生物素-链霉亲和素ELISA法检测DSA-GGT和ELISA法检测AFP对PHC诊断的灵敏度和特异度相近,且前者的重复性良好,可作为PHC诊断的较好检测方法;DSA-GGT与AFP联合检测可显著提高PHC诊断的灵敏度.
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生物素-链霉亲和素介导受体靶向卵巢癌SKOV3细胞量子点体外成像的研究
目的：研制一种生物素-亲和素系统（BAS）介导叶酸受体（FR）靶向量子点（QD）荧光探针，初步验证其靶向性及信号放大效应。方法：采用活泼酯法，将链霉亲和素（SA）与QD共价偶联制备QD-SA并对其物理特性进行验证；采用活泼酯法以牛血清蛋白为载体合成生物素化叶酸（FA）。通过生物素化FA与QD-SA结合制备BAS介导叶酸受体（FR）靶向QD探针，比较该探针对卵巢癌SKOV3细胞及FR表达阴性的肺癌A549细胞的识别情况，并验证其靶向特异性；对比该探针在生物素化FA孵育1、4 h时成像的效果；比较该探针与未经BAS介导的QD-FA探针在不同孵育时间对卵巢癌SKOV3细胞成像的差异。结果：BAS介导FR靶向QD探针可特异性识别FR表达阳性的卵巢癌SKOV3细胞，且孵育4 h较1 h荧光信号明显增强，同等条件下其产生的荧光强度较未经BAS介导的QD-FA探针明显增强。结论：制备了一种特异性好、灵敏度高的BAS介导FR靶向QD探针，该探针在卵巢癌早期诊断方面具有潜在应用价值。
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E-coli和Yeast菌体蛋白ELISA定量测定方法的建立
目的:提高酶联免疫吸附测定(ELISA)方法的灵敏度.方法:将聚苯乙烯微孔板(PS)经过紫外线(UV)辐照后,用葡萄球菌A蛋白(SPA)预包被,再应用生物素-链霉亲和素(BSA)反应建立双抗体夹心ELISA.结果:检测低限为1.95 ng/ml,方法的批内变异分别为7.96%和8.63%.结论:为菌体蛋白的测定提供了一种新的方法.
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利用生物素-链霉亲和素进行骨髓间充质干细胞的表面标记
背景：目前尚缺乏高效、无创的方式将干细胞植入靶器官，探索引导干细胞到达靶器官或组织的途径以及提高干细胞归巢效率是现今干细胞研究的重点领域之一。
目的：利用生物素-链霉亲和素反应体系建立一种简单可行的细胞表面化学修饰方法，并评价此方法进行骨髓间充质干细胞表面标记的效率及其对细胞生物学功能的影响。
方法：全骨髓培养法得到第3代骨髓间充质干细胞，采用流式细胞仪鉴定；以磺化生物素-N-羟基琥珀酰亚胺、生物素、链霉亲和素将黏附分子配体唾液酸化的路易斯抗原装备到骨髓间充质干细胞表面；通过荧光显微镜评估骨髓间充质干细胞表面标记的效率，锥虫蓝染色法检测骨髓间充质干细胞的活性， CCK-8比色法检测骨髓间充质干细胞的增殖功能；成脂、成骨诱导检测骨髓间充质干细胞多分化功能。
结果与结论：①全骨髓培养法培养2周，可得到第3代骨髓间充质干细胞，细胞表达CD90，CD29，不表达CD34和CD45。②以生物素及链霉亲和素成功将黏附分子配体唾液酸LewisX(SleX)装备到骨髓间充质干细胞表面，且对细胞活性、增殖、分化功能影响不大。③运用这种方法对细胞进行表型修饰，操作技术简单，修改效率可达88%，有望提高骨髓间充质干细胞的归巢率，未来会有广泛和重要的应用价值。 -
肺结核病患者PBMC膜白介素-2受体(CD25)表达及其临床意义
目的:探讨外周血单个核细胞(PBMC)膜白介素-2受体mIL-2R,(CD25)表达在肺结核病鉴别诊断中的应用价值.方法:用生物素-链霉亲和素(BSA)法检测肺结核、支气管肺炎患者T细胞亚群及植物血凝素(PHA)诱导前后CD25表达水平.结果:支气管肺炎患者CD+3、CD+4、CD+8水平分别为(62.32±6.34)%、(47.52±7.16)%、(32.12±6.55)%,CD+4/CD+8比值为1.52±0.43,PHA诱导前后CD25水平分别为(4.56±1.52)%、(35.12±7.21)%.空洞型肺结核CD+3、CD+4、CD+8、CD+4/CD+8水平分别为(41.13±5.25)%、(43.38±5.15)%、(36.25±3.46)%和1.15±0.21,非空洞型肺结核CD+3、CD+4、CD+8、CD+4/CD+8水平分别为(46.29±5.60)%、(47.21±4.86)%、(32.36±4.03)%、1.46±0.25,相互比较CD+3、CD+3/CD+8差异均有显著性(P＜0.01和P＜0.05).空洞型肺结核与非空洞型肺结核患者PHA诱导前后CD25水平分别为(2.13±1.14)%、(27.25±3.50)%和(3.43±1.35)%、(31.14±4.11)%,两者相比差异均有显著性(P＜0.01).结论:肺结核病患者体内存在明显的细胞免疫功能紊乱 ,主要表现为CD25表达水平降低,CD25表达水平与肺结核病的病情似有一定关系,其对肺结核病鉴别诊断具有重要价值.
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新生儿缺氧缺血性脑病患儿外周血CD25表达
目的 探讨新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)患儿外周血CD25表达.方法 应用生物素-链霉亲和素(BSA)法检测新生儿HIE患儿及足月正常新生儿出生后第1、7天外周血CD25水平.结果 HIE患儿生后第1天静息期和诱导期CD25水平分别为(3.7±1.2)%和(22.4±6.5)%,与正常对照组相比,差异有显著性(P＜0.05);随着通气、换气等综合性治疗时间的延长,患儿缺氧缺血症状逐步改善,生后第7天静息期和诱导期CD25水平分别为(4.1±1.5)%和(25.3±7.2)%,与正常对照组相比,差异无显著性(P＞0.05).其中HIE(重度)患儿静息期和诱导期CD25水平均较低,与正常对照组相比,差异有显著性(P＜0.01,P＜0.05).结论 HIE患儿存在一定程度的细胞免疫功能紊乱,主要表现为外周血CD25水平降低,并与HIE严重程度有关.
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新生儿缺氧缺血性脑病外周血T细胞亚群和膜白介素-2受体表达及临床意义
目的观察新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)患儿外周血T细胞亚群和膜白介素-2受体(mIL-2R)表达,探讨其临床意义.方法安徽省淮南市妇幼保健院新生儿科2002年5月至2003年10月收治HIE患儿32例.以Ficoll-Hypaque常规分离外周血单个核细胞(PBMC),用生物素-链霉亲和素(BSA)系统检测新生儿HIE及足月正常新生儿生后第1、3、7日CD+3、CD+4、CD+8、CD+4/CD+8阳性率,及PHA诱导前后mIL-2R表达水平.结果新生儿HIE患儿生后第1日CD+3、CD+4、CD+8阳性率及CD+4/CD+8、静息期和诱导期mIL-2R表达水平与正常对照组相比,差异有显著性(P<0.01或P<0.05);生后第3日与正常对照组相比,差异有显著性(P<0.05);生后第7日CD+3、CD+4、CD+8与正常对照组相比,差异有显著性(P<0.05),CD+4/CD+8与正常对照组相比,差异无显著性(P>0.05).在不同程度HIE患儿中,以重度HIE患儿细胞免疫功能异常明显.结论新生儿免疫细胞幼稚、未分化成熟、表达水平偏低,HIE病理过程有细胞免疫的改变及参与,HIE患儿存在一定程度的细胞免疫功能紊乱.
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血清食物不耐受特异性 IgG 检测方法的研究
目的：建立生物素-链霉亲和素间接包被方法检测疑似牛奶食物不耐受患者血清特异性 IgG 抗体。方法将链霉亲和素包被反应板，牛奶的三个组分：酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白标记生物素，并以3∶3∶1的比例混合，加入抗体及酶标抗人 IgG，检测绘制特异性 IgG 定量标准曲线，从而建立生物素-链霉亲和素抗原间接包被检测法检测牛奶特异性 IgG 抗体。并以美国 Biomercia 酶联免疫法作为参比方法进行方法学评价。结果本文建立的生物素-链霉亲和素间接包被法检测牛奶特异性抗体的批间精密度为7．0％-9．5％；批内精密度为4．6％-8．7％。与参比方法对比，灵敏度为92．1％，特异度为90．0％。结论本方法可用于检测牛奶特异性 IgG 抗体，用于牛奶制品引起的食物不耐受的体外诊断。
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检测细胞内细胞因子的生物素-链霉亲和素免疫细胞化学法的建立及初步应用
目的建立检测细胞内细胞因子的生物素-链霉亲和素免疫细胞化学法(BSA-ICC)并作临床初步应用.方法从健康人外周血单个核细胞(PBMC)中富集CD4细胞,加入莫能霉素,用不同浓度的佛波醇酯(PMA)和钙离子载体(A23817)诱导CD4细胞不同时间,比较其胞内表达白细胞介素-2(IL-2)/白细胞介素-4(IL-4)的细胞百分率,确定适诱生条件;用不同稀释度的IL-2McAb、IL-4McAb、不同浓度的生物素化羊抗鼠IgG(bio-SAM IgG)和辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP-SA)作棋盘配比试验,确认McAb、bio-SAM IgG和HRP-SA的适浓度,根据上述结果建立了检测细胞内细胞因子的BSA-ICC法.用所建方法检测20名健康献血员、16例妇科良性疾病和18例妇科恶性肿瘤患者CD4细胞中表达IL-2/IL-4细胞的百分率.结果诱导CD4细胞胞内表达IL-2和IL-4的细胞高百分率的PMA和A23817浓度分别为100 μg/L和2.0 μmol/L,诱导高峰时间分别为5和7 h,BSA-ICC法中所用IL-2McAb、IL-4McAb适稀释度分别为1∶ 20和1∶ 40,bio-SAM IgG和HRP-SA浓度分别为10～15 μg/ml和15 μg/ml.20名健康献血员、16例妇科良性疾病和18例妇科恶性肿瘤患者CD4细胞中分泌IL-2的细胞百分率分别为(45.90±4.39)%、(37.28±2.67)%和(25.19±3.49)%,分泌IL-4的细胞百分率分别为(10.5±1.50)%、(9.94±1.06)%和(16.13±2.50)%,IL-2+CD4+/IL-4+CD4+比值分别为3.65±0.94、3.55±0.76和1.27±0.26.结论所建方法可用于T辅助(Th)细胞亚型的测定,从而判断Th细胞的极化状态.妇科恶性肿瘤患者Th细胞功能失衡极化,呈Th2反应,可能与恶性肿瘤的发生有关.
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圆孢子虫感染者免疫功能表达的研究
本文探讨圆孢子虫感染者免疫功能的变化.对卵囊阳性患者,用生物素-链霉亲和素(BSA)法检测外周血T细胞亚群、膜白细胞介素-2受体(mIL-2R);用ELISA检测可溶性白细胞介素-2受体(sIL-2R)和血清特异性抗体IgG、IgM.结果显示上述指标与卵囊阴性者相比较,差异均有显著性.
关键词： 圆孢子虫 生物素-链霉亲和素 T细胞亚群 膜白介素-2受体 可溶性白介素-2受体 -
肺结核病患者mIL-2R、sIL-2R的检测及其临床意义
为了探讨肺结核病患者外周血单个核细胞(PBMC)膜白介素2受体(mIL-2R)和血清可溶性白介素2受体(sIL-2R)的表达及其在肺结核病鉴别诊断中的应用价值,应用生物素-链霉亲和素(BSA)法检测47例肺结核、25例支气管肺炎患者植物血凝素(PHA)诱导前后的mIL-2R表达水平,用ELISA法检测血清sIL-2R含量.结果发现支气管肺炎患者PBMC在PHA诱导前后mIL-2R水平分别为(4.56±1.52)%、(35.12±7.21)%,空洞型肺结核与非空洞型肺结核患者PHA诱导前后mIL-2R水平分别为(2.11±1.14)%、(27.25±3.50)%和(3.41±1.35)%、(31.17±4.11)%,支气管肺炎患者高于空洞性肺结核患者(P<0.01).支气管肺炎患者血清sIL-2R含量为(368±74) kU/L,空洞型肺结核与非空洞型肺结核患者血清sIL-2R含量为(1 156±98) kU/L、(978±91) kU/L,相互比较差异均有显著性(P<0.01).PBMC TB-DNA(+)者PHA诱导前后mIL-2R及血清sIL-2R水平分别为(2.08±1.16)%、(26.88±3.61)%、(1 174±83) kU/L,与PBMC TB-DNA(-)者相比,差异有显著性(P<0.01).研究认为肺结核病患者体内存在明显的细胞免疫功能紊乱,主要表现为mIL-2R表达水平降低,血清sIL-2R含量增高,结核杆菌感染PBMC后可进一步抑制mIL-2R表达.mIL-2R、sIL-2R表达水平与肺结核病患者的病情似有一定关系.
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测定小鼠细胞因子的双抗体夹心ELISA法的建立及应用研究
目的建立敏感的测定小鼠IL-5、IL-4和IFN-γ水平的生物素-链霉亲和素双抗体夹心ELISA法,并探讨该法在IL-5转基因小鼠感染模型中的应用价值.方法含大鼠抗小鼠IL-4、IL-5和IFN-γ单克隆抗体的杂交瘤细胞培养上清,经PM10膜超滤、50%饱和硫酸铵沉淀及Protein G-Sepharose亲和层析纯化.应用活化生物素制剂对纯化的TRFK4、BVD6和AN18单克隆体抗体进行生物素化.用纯化的2μg/ml TRFK5、8μg/ml 11B11和4μg/ml R4-6A2分别作为测定小鼠IL-5、IL-4和IFN-γ的包被抗体,然后逐步加入样品、生物素化TRFK4(1μg/ml)、BVD6(2μg/ml)和AN18(1μg/ml)、SA-HRPO和OPD,硫酸终止反应后读取A490值.结果所建立的生物素-链霉亲和素双抗体夹心ELISA法特异性和敏感性高,用于检测感染巴西日圆线虫感染的IL-5转基因小鼠和非转基因小鼠的血清标本取得了较好的效果.结论该ELISA方法对于测定小鼠细胞因子具有应用价值.
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生物素-链霉亲和素酶免疫法PSA测定的评价
目的评价生物素-链霉亲和素酶免疫分析法(BSA-ELISA)测定前列腺特异性抗原(PSA)并与化学发光法(CLIA)进行比较.方法根据EP9-A文件要求采集数据,并以相应软件分析这两种方法的相关性;同时对BSA-ELISA 的测定范围,变异系数(CV),小检测限进行测定.结果两种方法测定的结果具有较好的相关性,回归方程y=0.985X-0.131,相关系数(r)=0.997.PSA的批内平均CV为2.21%,批间平均CV为3.08%.测定范围为1.50～85.μg/L.小检测限为0.30μg/L.结论采用全自动酶免疫分析仪的BSA-ELISA与CLIA自动分析仪测定PSA的相关性好,结果稳定,偏差小,可以在临床上常规应用.
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缺氧缺血性脑病新生儿血细胞因子表达的意义
目的观察缺氧缺血性脑病(HIE)新生儿血CD25、CD25 mRNA和IL-1β表达水平,探讨其临床意义.方法Ficoll常规分离外周血单个核细胞,用生物素-链霉亲和素、Real-time PCR和ELISA法分别检测新生儿HIE患儿及足月正常新生儿生后d1、3、7植物凝集素(PHA)诱导前后CD25、CD25 mRNA及IL-1β水平,以CD25 cDNA与磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)比值为CD25mRNA终相对表达量.结果HIE患儿生后d1静息期和诱导期CD25表达水平分别为(3.6±1.1)%、(20.9±4.8)%,IL-1β为(17.7±8.2)ng/L,与正常对照相比,差异有显著性(P＜0.01,0.05).生后d3CD25表达水平分别为(3.9±1.2)%、(22.8±5.1)%,IL-1β为(15.9±4.9)ng/L,与正常对照相比,静息期差异有显著性(P＜0.01,0.05).生后d7静息期和诱导期CD2表达水平分别为(4.1±1.2)%、(23.8±5.2)%,与正常对照相比,静息期差异有显著性(P＜0.05),IL-1β为(15.0±3.8)ng/L,差异有显著性(P＜0.01).HIE患儿CD25mRNA与对照组相比,无显著差异(P＞0.05).结论HIE患儿存在明显炎症反应;新生儿免疫细胞表面CD25表达水平偏低,但其mRNA水平稳定,具有一定免疫调节能力,可参与HIE脑损伤的修复.
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生物素-链霉亲和素技术一步法检测人心肌肌钙蛋白T
目的:用已获得的两株抗人心肌肌钙蛋白T(cTnT)单克隆抗体N15C和N16D建立检测cTnT的生物素-链霉亲和素技术一步法.方法:应用酯化生物素对N15C进行标记,应用辣根过氧化物酶对N16D进行标记.将待检血清或抗原标准品、生物素标记的N15C和酶标记N16D加入经链霉亲和素包被的96孔酶标板微孔中,然后加入OPD,硫酸终止反应后,在λ=490 nm处读取A值,根据标准曲线求出各样本值.结果:建立的方法检测cTnT,检测灵敏度为1.0 μg/L,可定量检测范围为2.0～32.0μg/L.11例AMI患者和10例正常人用该法进行血清检测,与Enzymun*Test TnT试剂盒相比,阳性符合率为82%,特异性为100%.经重复检测表明本方法检测低浓度cTnT批内变异系数为4.70%,批间变异系数为9.36%;检测高浓度cTnT批内变异系数为3.20%,批间变异系数为8.25%.结论:该方法特异性高,重复性好,较常规双抗体夹心ELISA法有更高的灵敏度.
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应用纳米金探针检测HSV-2的目视化基因芯片
本实验建立了一种应用金标链霉亲和素探针的目视化高灵敏度检测单纯疱疹病毒2型(Herpes Simplex Virus-2, HSV-2)的基因芯片.该芯片以HSV-2 DNA 聚合酶的高保守区为靶序列,设计HSV-2特异性引物和探针,通过PCR反应使扩增产物标记上生物素;氨基修饰的探针固定在活化的玻片上,与生物素标记的扩增产物杂交;利用生物素与链酶亲和素高亲合力的特性,加入纳米金标记的链酶亲和素后形成生物素-链酶亲和素-纳米金生物反应放大系统;银染反应后,达到目视化检测HSV-2效果.该HSV-2检测基因芯片能目视化检测出100fmol/L的HSV-2扩增产物,具有灵敏度高,低成本的特点,通过临床标本验证表明该芯片具有较高的准确性.
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新生儿缺氧缺血性脑病细胞免疫功能的变化及其临床意义
目的观察新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)患儿外周血T细胞亚群和膜白介素-2受体(mIL-2R),血清IL-1β,IL-6,IL-10表达水平,探讨免疫学变化在HIE发病中的意义.方法用生物素-链霉亲和素(BSA)系统检测新生儿HIE及足月正常新生儿生后第1,3,7天CD3+,CD4+,CD8+,CD4+/CD8+阳性百分率,及植物血凝素(PHA)诱导前后mIL-2R表达水平.用ELISA法动态检测新生儿及足月正常新生儿出生第1,3,7天血清IL-1β,IL-6,IL-10水平.结果新生儿HIE患儿生后第1天CD3+,CD4+,CD8+分别为(37.4±6.7)%、(29.4±6.9)%、(16.7±3.3)%,CD4+/CD8+为1.8±0.5,静息期和诱导期mIL-2R表达水平分别为(3.6±1.1)%、(20.9±4.8)%,与正常组相比,差异有显著性(P＜0.01～P＜0.05).生后第3天CD3+,CD4+,CD8+分别为(41.0±7.4)%,(35.8±6.9)%,(22.6±4.5)%,CD4+/CD8+为1.7±0.5,静息期mIL-2R表达水平(3.9±1.2)%,与正常组相比,差异有显著性(P＜0.05).生后第7天CD3+,CD4+,CD8+分别为(41.8±6.1)%、(36.4±5.1)%、(25.6±4.3)%,与正常组相比,差异有显著性(P＜0.05).CD4+/CD8+比值为1.5±0.3,诱导期mIL-2R表达水平(23.8±5.2)%,与正常组相比,差异无显著性(P＞0.05).HIE患儿血清IL-1β,IL-6,IL-10水平均显著高于正常组(P＜0.05～P＜0.01).结论HIE患儿存在一定程度的细胞免疫功能紊乱,与疾病的严重程度密切相关,其表达水平可作为HIE早期诊断、评价脑损伤程度及预后的参考指标.
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结核病患者mIL-2R、sIL-2R表达的检测及其临床意义
1 材料和方法研究对象:2001年10月至2002年10月我院附属医院、教学医学及淮南市其它各大医院的门诊和住院经确诊的结核病患者56例,男31例,女25例,年龄17～66岁.另选取本市中心血站健康献血员20名为对照组,男12名,女8名,年龄26～39岁.
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医学生外周血单个核细胞CD25、CD25mRNA表达
[目的]探讨正常医学生外周血单个核细胞(PBMC)中CD25、CD25 mRNA表达水平,为了解机体生理状态下细胞免疫功能提供实验依据.[方法]用生物素-链霉亲和素(BSA)法检测150名(男91人,女59人)在校医海陆空生外周血单个核细胞植物血凝素(PHA)诱导前后CD25水平,Real-PCR法法检CD25 mRNA含量.[结果]男生PHA诱导前后CD25水平分别为(4.66±1.23)%、(33.12±7.02)%,CD25 mRNA含量分别为1.516 5±0.275 0、1.6050±0.2502;女生PHA诱导前后CD25水平分别为(4.59±1.34)%、(34.78±7.75)%,CD25 mRNA含量分别为1.4420±0.2428、1.7103±0.2755,两者相比,诱导期女生CD25 mRNA水平偏高,差异有统计学意义(P＜0.05).[结论]医学生PBMC是CD25、CD25 mRNAge表达正常,女生PBMC对PHA具有更高的反应性.
