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鼻疽诺卡菌感染小鼠足垫后组织病理变化以及细胞因子分泌情况的初步研究
目的 了解鼻疽诺卡菌感染动物模型小鼠足垫后不同时间的组织病理进展变化以及细胞因子分泌情况,为鼻疽诺卡菌致病机制研究提供依据.方法 应用对数生长期的鼻疽诺卡菌注射于小鼠足垫,建立感染模型.将感染1、3、7、14 d后小鼠分别脱臼处死,用手术刀片切取感染小鼠的足垫,制备切片,应用HE染色观察组织不同时间的病理变化,通过免疫组化研究感染过程中IL-6、IL-12、IFN-γ、TNF表达分泌情况.结果 通过HE染色观察到感染后第1天中性粒细胞浸润,炎症形成;感染后第3天中性粒细胞脓肿形成,进入急性感染时期;感染后第7天肌肉组织间大量肌纤维母细胞及血管内皮细胞增生,感染转入慢性感染时期;感染后第14天肌肉组织间大量肌纤维母细胞及血管内皮细胞增生,见局灶小脓肿,周围见片状增生的泡沫样巨噬细胞,进入感染修复期.组织免疫组化结果显示,在炎症形成时期,组织中的IL-6和TNF表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);在急性感染期,组织中仅可见TNF表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);在慢性感染期,组织中IL-6、IL-12、IFN-γ和TNF表达量均高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);在感染修复期,组织中的IL-6、IFN-γ和TNF表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 鼻疽诺卡菌感染小鼠足垫后出现明显的病理变化周期,在感染第3天开始进入急性感染时期,感染后第7天转入慢性感染时期,感染后第14天进入组织修复期,并且IL-6、IFN-γ、TNF参与了炎症反应,尤其是IL-6表达量高,主要促进Th0向Th1和Th17亚群分化,激活巨噬细胞、树突状细胞和NK细胞等,增强其吞噬和杀伤功能,以杀伤胞内鼻疽诺卡菌.
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鼻疽诺卡菌菌体蛋白的免疫蛋白质组学研究
目的 通过鉴别鼻疽诺卡菌菌体蛋白中具有免疫原性的蛋白,为筛选鼻疽诺卡菌特异诊断抗原提供线索.方法提取鼻疽诺卡菌菌体蛋白进行双向电泳,结合免疫印迹法筛选与抗鼻疽诺卡菌兔血清发生免疫反应的蛋白点.结果 在鼻疽诺卡菌菌体蛋白的免疫杂交膜上,共发现9个具有抗原活性的蛋白,其中8个可在考马斯蓝染色胶上找到匹配点,通过介质辅助激光解吸电离飞行时间质谱成功鉴定8个蛋白,全部定位于胞内.结论 本研究成功建立鼻疽诺卡菌免疫蛋白质组学方法,在鼻疽诺卡菌菌体蛋白中发现新的具有免疫原性的蛋白,可作为鼻疽诺卡菌特异性诊断候选抗原,用于诊断试剂的研究.
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鼻疽诺卡菌mce4A基因缺失株的构建及其相关功能研究
目的 构建鼻疽诺卡菌IFM10152哺乳动物侵袭基因4A(mammalian cell entry 4A,mce4A)缺失株,并分析该基因在鼻疽诺卡菌感染宿主细胞中发挥的作用.方法 采用无抗生素标记的框内缺失法构建鼻疽诺卡菌mce4A基因缺失株,通过PCR及测序的方法进行验证.进行体外生长实验、用THP-1(人白血病单核细胞系)作为体外模型进行巨噬细胞杀菌试验以及用HeLa(宫颈癌上皮细胞系)细胞进行体外黏附侵袭试验来分析mce4A基因在鼻疽诺卡菌与宿主细胞相互作用中发挥的功能.结果 成功构建无抗生素标记的mce4A基因框内缺失株,命名为△mce4A;缺失株与野生株生长速度无明显差异.通过实验证明,mce4A基因敲除后,鼻疽诺卡菌抵抗巨噬细胞杀伤能力明显减弱,且鼻疽诺卡菌的黏附侵袭能力也明显减低.结论 成功构建了鼻疽诺卡菌mce4A基因缺失株,mce4A基因在鼻疽诺卡菌黏附侵袭宿主细胞及巨噬细胞内存活过程中可能发挥了重要作用.
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高糖高脂对鼻疽诺卡菌作用于RAW264.7巨噬细胞的影响
目的 在体外培养巨噬细胞RAW264.7的基础上以高糖高脂刺激,检测巨噬细胞与鼻疽诺卡菌作用后的免疫指标,探讨高糖高脂对巨噬细胞免疫功能的影响.方法 体外培养RAW264.7巨噬细胞,分为5组,对照组为常规培养,实验组分为4组:高糖组以50 mmol/L葡萄糖培养,高脂1组以10 mg/L溶血卵磷脂培养,高脂2组以25 mg/L溶血卵磷脂培养,高脂高糖组以50 mmol/L葡萄糖+25 mg/L溶血卵磷脂培养.检测不同条件培养6、12、24、36 h后各组巨噬细胞的细胞活性.5组巨噬细胞分别用以上条件培养24 h后与鼻疽诺卡菌作用,动态追踪检测巨噬细胞与鼻疽诺卡菌作用1、2、3、4、5、6h后的吞噬率,及作用1、3、6h后诺卡菌对不同细胞组的细胞毒性大小和细胞因子IL-10、TNF-α的分泌量.结果 高糖高脂培养使巨噬细胞活性降低,培养24 h后各实验组与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01).高糖高脂的刺激降低了巨噬细胞对鼻疽诺卡菌的吞噬能力,高糖组、高脂2组在1、2h,高脂1组在1、2、3h,高糖高脂组在1、2、3、4h处对鼻疽诺卡菌的吞噬率低于对照组(P<0.05或P<0.01).与对照组比较,鼻疽诺卡菌对各实验组的细胞毒性减低(P<0.05或P<0.01).与对照组相比,高脂1组、高脂2组、高糖高脂组在作用3 h后IL-10的分泌量低于对照组(P<0.05);高糖组、高脂1组在作用1 h后TNF的分泌量低于对照组(P<0.05).结论 高糖高脂培养可降低巨噬细胞的活性,降低巨噬细胞对鼻疽诺卡菌的吞噬能力,并影响鼻疽诺卡菌对巨噬细胞的毒性作用以及巨噬细胞细胞因子IL-10、TNF-α的分泌量.
关键词： 鼻疽诺卡菌 RAW264.7巨噬细胞 高糖 溶血卵磷脂 吞噬 -
鼻疽诺卡菌哺乳动物细胞侵袭蛋白的生物信息分析及抗原表位预测
目的 分析鼻疽诺卡菌哺乳动物细胞侵袭(mammalian cell entry protein,mce)蛋白与其他菌该蛋白的亲缘关系,预测鼻疽诺卡菌mce1操纵子中mce蛋白(mce1A-1F)的二级结构及B细胞抗原表位. 方法 通过NCBI的GeneBank数据库查找mce基因序列和氨基酸序列,通过BLAST获取不同菌的mce同源性序列,利用软件Lasergene7.0对基因序列和氨基酸序列进行比对,并通过软件MEGA 6.0对mce氨基酸序列进行多重比对并建立系统发育树.采用蛋白分析专家系统(Expert Protein Analysis System,ExPASy)对鼻疽诺卡菌mce1操纵子中的mce蛋白质的二级结构及跨膜结构进行预测.利用在线软件BepiPred及Lasergene7.0软件包中的可塑性、表面可及性、抗原性及亲水性等多项参数预测其B细胞抗原表位. 结果 mce蛋白在分枝杆菌属、诺卡菌属、红球菌属及钩端螺旋体中均存在且具有一定的同源性.鼻疽诺卡菌mce1操纵子中mce蛋白的二级结构主要以不规则卷曲和α螺旋为主,并都存在一个明显的跨膜结构.除了mce1C蛋白仅有2个B细胞抗原表位,其余mce蛋白均含有较多潜在的B细胞抗原表位(其中mce1A蛋白6个、mce1B蛋白7个、mce1D蛋白6个、mce1E蛋白6个、mce1F蛋白10个). 结论 鼻疽诺卡菌mce蛋白与其他菌mce蛋白均存在不同程度的亲缘关系.鼻疽诺卡菌mce蛋白很可能都是跨膜蛋白,其二级结构中以不规则卷曲结构较多,并存在较多潜在的B细胞抗原表位.
关键词： 哺乳动物细胞侵袭蛋白 鼻疽诺卡菌 生物信息分析 二级结构 抗原表位
