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牛百叶中检出O139群霍乱孤菌
目的:全国霍乱疫情以聚集性为主,菌型(群)单一,血清学分型全部为O139群霍乱孤菌.霍乱孤菌监测选择外环境水体监测、食品监测、水产品监测和腹泻病人监测.卫生部对其它标本也做了具体的监测要求.作者在小崔各庄李××家中销售牛内脏的冷库内采集货架棉拭子涂抹样品3份,牛百叶4份.在1号牛百叶中检出O139群霍乱孤菌.牛也是霍乱孤菌的带菌宿主之一.
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霍乱弧菌检验研究进展
霍乱是一种烈性传染病,其致病菌为霍乱孤菌.霍乱孤菌是孤菌属的一个种,有2个生物型(古典生物型与埃尔托生物型),均为O1群血清型.长期以来,对该菌的鉴定都采用传统的检验方法,即形态学、生理生化特征及血清学鉴定,系细胞水平鉴定,快也要十几个小时才能完成.近来来,国内外已开始应用PCR技术[1]、DNA探针技术对霍乱孤菌特别是流行株的鉴定.还有几种分子生物学水平的鉴定方法,也逐步应用到霍乱孤菌的检验中.这些简单、快速、特异性强的检验方法,已得到广大医疗、卫生防疫实验室人员的关注,并成为研究的课题.
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产毒型霍乱弧菌实时荧光三重TaqMan聚合酶链反应检测体系的临床应用前研究
目的:探讨产毒型霍乱弧菌实时荧光三重TaqMan聚合酶链反应检测体系对临床模拟标本检测的意义,为该检测体系的临床应用提供可靠的技术依据.方法:将已知浓度霍乱弧菌灭活菌株悬液连续10倍稀释后与新鲜健康成人粪便混匀;制备成含菌量为5.0×101CFU/g～5.0×109 CFU/g梯度浓度的模拟带O1群霍乱弧菌者粪便标本和含菌量为5.0×101CFU/g～5.0×108CFU/g梯度浓度的模拟带O139群霍乱弧菌者粪便标本;用以评价我们自主建立的产毒型霍乱弧菌实时荧光三重TaqMan聚合酶链反应检测体系对临床模拟标本检测的敏感度、特异性和稳定性.结果:该实时荧光三重TaqMan聚合酶链反应快速检测体系对O1群霍乱弧菌或O139群霍乱弧菌的模拟带菌者粪便标本的检测敏感度均为1.0×103CFu每反应体系,亦相当于模拟带菌者粪便标本5.0×104CFU/g;对不同含菌量的模拟带菌者粪便标本的3次重复实验结果显示,各靶序列扩增反应Ct值的检测变异系数均小于5%;对新鲜健康成人粪便标本的检测未见明确的异常扩增.结论:我们建立的产毒型霍乱弧菌实时荧光三重TraqMan聚合酶链反应检测体系可作为O1群或O139群产毒型霍乱弧菌临床粪便标本敏感、特异和稳定的检测手段.
关键词： 霍乱孤菌 Taqman聚合酶链反应 霍乱肠毒素 -
O139群霍乱弧菌β-内酰胺酶相关耐药基因检测及分析
目的:通过检测分析2004年至2005年21株O139群霍乱弧菌临床分离株对β-内酰胺类抗生素耐药情况和菌株β-内酰胺酶相关耐药基因携带情况,探讨产生耐β-内酰胺类抗生素的分子生物学机制.方法:K-B纸片扩散法药物敏感实验检测细菌耐抗菌药物情况,PCR方法扩增CARB-2、TEM、OXA、VEB和SHV型β-内酰胺酶相关耐药基因,同时用PCR方法检测1型整合子结构.结果:21株O139群霍乱弧菌均对氨苄西林和羧苄西林等耐药,而对头孢噻肟等敏感,PCR均检出TEM-1耐药基因,检出率达100%.未检出CARB-2、OXA、VEB和SHV等基因.测序分析证明该耐药基因与AF397075有高度同源性.PCR定位实验表明该耐药基因不存在于1型整合子内.三相水解实验证明这种耐药为β-内酰胺酶引起.结论:从O139群霍乱弧菌中检出β-内酰胺酶相关TEM-1耐药基因,介导对氨苄西林和羧苄西林等的耐药.
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多重PCR与PCR-荧光探针法检测外环境霍乱弧菌的比较研究
目的:对比多重PCR与PCR-荧光探针法从外环境中直接检测霍乱弧菌的效果.方法:收集40份水样和40份水产品样本,再以20份已知特性菌株作对照.将上述样本和菌株进行培养后提取模板,分别进行多重PCR和PCR-荧光探针法检测.结果:两种方法均从40份水样中检出14份非O1非O139群霍乱弧菌,两种方法均能从40份水产品中检出29份O1群霍乱弧菌及3份非O1非O139群霍乱弧菌.以上检出霍乱弧菌均可经血清学试验证实.20份已知特性样本两种方法均鉴定无误,低检出限均为102 cfu/ml.结论:两种方法灵敏度和特异度均极高,多重PCR方法因能同时进行致病力的初步判断,检验速度相对较快,成本较为经济而更为实用.
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海、水产品霍乱弧菌检测结果分析
目的:为了解海、水产品的霍乱弧菌污染状况、菌型特征、耐药情况及毒力水平等.方法:采用中国CDC统一规定的检测方法及霍乱防治手册中的有关要求进行检测.结果:从300份海、水产品中共检出6株霍乱弧菌(小川、稻叶、O139群各2株).结论:本次调查所检测到菌株的菌型复杂,O1群和O139群对药物敏感试验有所差异,同种菌型之间具有高度同源性,经毒力基因检测均为产毒株,具有流行及致病的可能性.
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一种用于检测外环境低浓度霍乱弧菌的新方法
为了有效地消灭与预防霍乱疾病的发生,对外环境进行定期的霍乱弧菌检测十分必要.目前对外环境检测分离培养获得霍乱弧菌菌株的检测方法仍然是微生物检验领域的“金标准”.研究表明,因各种细菌之间存在相互拮抗等现象,会直接影响到对目的菌的检出.特别是食品、水体和海产品霍乱弧菌的携带量较少,而且存在大量干扰因素,很难用现有的培养检测方法获得阳性菌株[1-3].曾做过一个实验,配制每毫升中含有1 000个霍乱弧菌的菌液,分别取此菌液5μl接种在《霍乱防治手册》规定的强选择性培养基上[4],平行5个平板,结果全部有霍乱弧菌生长.
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霍乱弧菌分子生物学检测方法概述
霍乱弧菌是导致感染者严重腹泻的病原菌,能引起大范围乃至世界性的流行.霍乱弧菌快速检测及分型结果是制定霍乱防控的重要依据.近年来,分子生物学技术越来越多地应用到霍乱弧菌的研究中,相关测试方法的飞速发展为霍乱弧菌的检测提供了新的手段,分子生物学检测可从分子水平上研究菌株的变异以及不同菌株之间的遗传关系,对霍乱爆发的传染源追踪,确定霍乱菌株类型和流行性质,具有重要意义.本文就霍乱弧菌分子生物学检测技术方法进行概述:
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水产品中霍乱弧菌检测结果报道
霍乱是由霍乱弧菌感染机体所致的一种甲类传染病,对外环境标本进行常规监测是霍乱防治工作的重要组成部分.但霍乱弧菌常规监测阳性结果可能性极低,常规培养分离鉴定法工作量大,检测中检验人员容易出现侥幸心理,从而可能因为漏检,造成严重的后果.
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霍乱弧菌O139群CTXψ和nct-CTXψ基因组共存新型结构
目的 霍乱孤菌(VC)0139群CTXψ和nct-CTXψ基因组共存新类型的结构研究. 方法 分别扩增CTXψ或nct-CTXψ基因组串联体的第一个基因组末端和第二个起始端之间的基因,扩增片段再经RsaI和BgⅢ酶切、型特异引物PCR方法,区分rstR-ig2类型;扩增TLC和RS区之间片段并区分rstR-ig2类型;扩增RTX与CTXψ或nct-CTXψ核心区之间片段.结果 O139群VC代表菌株及CTXψ和/或nct-CTXψ的rstR-ig2类型(以上标表示)如下,FJ9510株CTX ETψ、FJ98352株CTXETψ+nct-CTX calcψ、FJ99364株CTXETψ+nct-CTX newO139ψ+nct-CTX calcψ、JS9803株CTXETψ+nct-CTX newO139ψ、JX94484株CTXETψ+nct-CTX newETψ;不同rstR-ig2类型CTXψ和nct-CTXψ基因组zot基因3'末端46bp序列中20个位点不同,推测的15个氨基酸序列中11个位点不同;O139群VC CTXψ基因组附近序列均为TLC和RTX基因簇,而nct-CTXψ基因组附近均为未知或新类型序列.结论 阐明O139群VC CTXψ和nct-CTXψ基因组共存新类型主要变异区及染色体插入位点附近结构.
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5株不同群型霍乱弧菌黏粒文库构建及JS9803株文库应用
目的 研究5株不同群型霍乱弧菌(VC)黏粒文库的构建.方法 染色体DNA提取、酶切,质粒DNA提取、酶切及去磷酸化,连接、包装、转染、铺板,克隆子鉴定和保存、菌落原位杂交,PCR和测序.结果 成功构建吴江-2株(EVC流行株产毒株)、86015株(EVC流行株非产毒株)、JS32株(EVC非流行株非产毒株)、JS9803株(O139群VC产毒株)和GD98200株(O139群VC非产毒株)等5株霍乱弧菌的染色体基因组黏粒文库,文库克隆子中插入35～45kb的染色体DNA片段,库容量分别为3000～5000克隆子.从JS9803株文库中筛选出分别携带CTXψ或nct-CTXψ基因组的克隆子,后一克隆子携带的rstR-ig2基因为新类型.结论 成功构建5株不同群型霍乱弧菌染色体基因组黏粒文库,并对JS9803株文库进行应用.
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海南省2005年霍乱暴发菌株PFGE图谱研究
目的 分析海南省2005年霍乱菌株暴发分离株的分子特征及菌株之间的分型相似性.为防治工作提供病原依据,并与PulseNet China提供资料进行相关分析.方法 对分离株进行噬菌体-生物分型,通过PCR检测霍乱毒素基因.利用脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行分子分型和相似性聚类分析.结果 54株分离株中有51株为产毒株,稻叶血清型,噬茵体-生物分型为1b型,其余3株为非流行株.全部菌株被分为15种PFGE带型,聚类分析大部分产毒株之间高度相似,并与PulseNet China提供资料证实,与同时福建、广东、浙江流行的稻叶型菌株带型相同.结论 海南省2005年稻叶型暴发菌株,属于2005年流行的茵型,提示在我国东南沿海地区的广泛扩散.
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霍乱弧菌ctxB基因真核重组质粒的构建及表达
目的构建霍乱孤菌ctxB基因真核表达重组质粒,并在NIH3T3细胞中进行表达.方法用限制性核酸内切酶从重组质粒pET32a-ctxB上切下ctxB基因,导入真核表达载体pcDNA3.1(+),重组子经限制性酶切分析、PCR鉴定正确后,命名为pcDNA3.1-ctxB.用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-ctxB转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法对pcDNA3.1-ctxB的瞬时表达产物进行鉴定.结果约380 bp的ctxB被克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中,经测序无误后,用阳离子脂质体转染的方法,检测到重组质粒pcDNA3.1-ctxB在NIH3T3细胞的胞浆和胞膜上得到了表达.结论 ctxB真核表达的成功构建及表达为进一步从分子水平研究霍乱肠毒素B亚单位的免疫原性及其作为佐剂的应用价值提供研究基础.
