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DNA芯片技术及其在营养学中的应用
DNA芯片技术是近年来迅速发展起来的分子生物学技术,该技术在人类基因组计划、新基因克隆、疾病诊断等许多生命科学领域已得到广泛应用,并显示出快速准确、多功能、微型化和自动化等无可比拟的优点.营养学作为生命科学的重要分支之一,DNA芯片技术在营养学中也有着潜在的广泛应用前景.本文就DNA芯片技术的原理、主要流程、优点及在营养学中的应用前景作一综述.
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DNA条形码识别——DNA条形码与DNA芯片识别蚊媒准确性的比较
[目的]比较DNA条形码和DNA芯片这2种技术平台在口岸医学媒介蚊类识别中的准确性.[方法]以20种媒介蚊类的线粒体COI基因序列信息为分析对象,采用NJ邻接法计算公认的DNA条形码区域在物种识别中的准确性,采用DNA芯片技术分析2种长度探针在物种水平识别中的差异.[结果]DNA条形码的准确性为98.5%,数据集中95%物种的唯一序列短长度为50bp左右;DNA芯片的准确性为90%～98.4%,25bp探针比55bp探针更具优势.[结论]DNA条形码和DNA芯片都能够准确地识别20种媒介蚊类,DNA条形码芯片技术有望在口岸出入境检验检疫领域得到应用.
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DNA条形码在国境卫生检疫中的应用
综述了DAN条形码的发展历史、识别原理以及公共数据库,并讨论了DNA条形码在检验检疫领域的应用前景.DNA条形码与DNA芯片技术的结合,可在检验检疫领域中实现非专家鉴定.
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转基因大豆DNA检测芯片的研究
为提高对转基因大豆的监督检测能力,研制了转基因大豆DNA检测芯片.根据转基因大豆(Roundup Ready)中所转入的外源基因,选择CaMV35S启动子、NOS终止子、NOS/EPSPE基因和内源Lectin基因设计特异性引物,采用多重PCR法对待测样品进行扩增,通过缺口平移法合成DIG-dUTP标记杂交探针,并制备基因芯片.在对PCR反应和扩增产物与芯片杂交条件进行优化的同时,比较了芯片检测的特异性和重复性,并对检测的灵敏度进行测试.结果表明,该方法具有较好的特异性和重复性,检测灵敏度可达0.5%,由于采用了多重PCR技术,一次可同时检测多个基因,提高了检测的准确性和效率.
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基因芯片技术在癌症研究中的应用
癌症的发生和发展是一个复杂的多阶段过程.通常由于某些基因突变和异常表达所致,或者进一步影响另外一些基因的表达发生变化,从而导致细胞内一些蛋白质分子发生改变,并由此产生癌症病理学上的差异,形成临床诊断中的不同分类.因此对癌症生物学特征的研究应从基因、蛋白质、细胞、组织等不同水平进行.基因芯片技术是20世纪90年代中期发展起来的一种新兴分子生物学技术,它在基因分析方面具有高通量、大规模、速度快等特点,将这些特点用到涉及到众多基因改变的癌症研究中,可以使人们更全面深刻地了解癌症发生发展,为癌症的诊治打下坚实的基础.本文就近年来基因芯片在癌症研究与治疗中的应用进展进行综述.
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肺癌药敏芯片的研究进展
目的 探讨基因芯片技术在肺癌个体化治疗方面的应用前景.方法 收集DNA芯片技术、肺癌化疗相关基因、及肺癌个体化化疗方面的研究文献,总结并探讨DNA芯片技术在肺癌个体化化疗方面的应用前景.结论 高通量DNA芯片技术为肺癌的分子水平研究提供了手段,为肺癌个体化化疗方案的制定、以及调整用药方面提供参考.
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"劳倦过度、房室不节"肾阳虚小鼠模型脑基因芯片研究
目的:应用基因芯片探讨"劳倦过度、房室不节"肾阳虚小鼠模型脑基因改变,试图说明传统中医建模方法及其肾阳虚表现,力求从基因水平上揭示肾阳虚的本质.方法:采用雄雌鼠比例1:6同笼喂养和雄鼠每日游泳4周,以诱导"劳倦过度、房室不节"肾阳虚鼠模型.用36K mouse genome array鼠脑芯片检测正常对照组和肾阳虚模型组鼠脑基因,并以二者荧光信号相对强度比值≥2和≤0.5筛选差异显著基因,并进一步查阅北京博奥生物分子注释系统,进行基因功能归类.结果:诱导成功"劳倦过度、房室不节"肾阳虚鼠模型,绘制了对照组与模型组基因表达谱比较的散点图.共筛选出186个差异表达基因,其中上调基因150个,下调基因364个.其中共有已知基因98个,上调已知基因71个,下调已知基因27个.下调基因中主要为生长激素、泌乳素、促性腺激素、黑色素和脑脂肪酸结合蛋白(B-FABP)相关基因;上调基因主要为炎症,免疫、促细胞凋亡相关基因以及影响多巴胺生成的限速酶、影响凝血纤溶机制和精子发育代谢的相关基因.结论:通过基因芯片对肾阳虚动物模型的检测,从基因水平上对肾阳虚证的本质做了一些诠释.
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"劳倦过度、房室不节"肾阳虚小鼠模型睾丸基因芯片研究
目的:应用基因芯片探讨"劳倦过度、房室不节"肾阳虚小鼠模型睾丸基因改变,从基因水平上探讨肾阳虚证和"肾主生殖"的现代科学机制.方法:连续4周采用雄雌鼠比例1:6同笼喂养和雄鼠每日游泳,建立"劳倦过度、房室不节"肾阳虚小鼠模型.用小鼠全基因组Oligo芯片检测对照组和模型组睾丸基因,以二者荧光信号相对强度比值≥2和≤0.5筛选差异表达基因,查阅北京博奥生物分子注释系统,进行基因功能分类.结果:成功建立"劳倦过度、房室不节"肾阳虚小鼠模型,绘制了对照组与模型组基因表达谱比较的散点图,筛选出差异表达基因,包括上调2 425个,下调3 0805.其中上调基因前百位中已知基因41个,下调基因前百位中已知基因62个,主要涉及细胞结构/功能、物质/能量代谢、信号转导/传递、炎症/免疫、细胞凋亡、转录/翻译、增殖/分化及细胞周期等.结论:肾阳虚小鼠睾丸基因发生广泛的改变,从基因水平对肾阳虚证的本质及"肾主生殖"的理论做出了一些诠释.
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2型糖尿病脾虚证免疫与物质代谢相关基因差异表达的研究
目的:研究2型糖尿病脾虚证与血瘀证患者外周血白细胞差异基因表达谱,从免疫和物质代谢角度探讨脾虚证证候本质和临床辨治规律.方法:选择12例2型糖尿病患者(6例脾虚证和6例血瘀证),抽提外周血白细胞总RNA,质检合格后,利用Agilent人类全基因组芯片筛选两证型间的差异表达基因,并对差异基因进行生物信息学分析.结果:共获得两证型34个有效差异表达基因,下调基因20个(60％),上调基因14个(40％),主要涉及白细胞免疫调节和物质代谢;非监督层次聚类显示可以将该差异基因通过聚类分开.结论:2型糖尿病脾虚证患者存在免疫功能紊乱,并且具有特征性基因表达谱.
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金匮肾气丸、右归丸对肾阳虚小鼠模型以药反证的脑基因芯片研究
目的:在基因水平上探讨补肾中药金匮肾气丸、右归丸对肾阳虚小鼠模型的作用机制.方法:昆明种小鼠分为正常组、模型组、金匮组和右归丸组.正常组和模型组每天灌胃蒸馏水0.5 mL;金匮组和右归丸组每天分别灌胃金匮.肾气丸混悬液和右归丸混悬液0.5 mL,含生药129 mg·kg~(-1).造模组和治疗组均采用雄雌鼠比例1:6同笼喂养,雄鼠每日游泳1次,直至无力下沉时捞出,达4周,以诱导产生"劳倦过度、房室不节"肾阳虚证.观察动物的畏寒、活动及反应、饮食和皮毛等情况.用36K mouse genome array鼠脑芯片检测正常组和肾阳虚模型组鼠脑基因,并以二者荧光信号相对强度比值≥2和≤0.5筛选差异显著基因,用qRT-PCR对部分差异表达基因进行验证.结果:模型组/正常组上调基因,二药治疗组/造模组基因下调23个基因,主要是与炎症/免疫、神经传递/信号转导等相关基因;造模组/对照组下调基因而治疗组/造模组基因上调的基因有6个,其主要是与细胞周期/细胞结构、神经传递/信号转导、转录等有关基因.qRT-PCR也证实了金匮组/模型组、模型组/正常组的GH和Scgb3a1的差异表达.结论:金匮肾气丸、右归丸可使肾阳虚小鼠模型显著下凋的激素、黑色素显著上调并促进细胞增殖,从而在基因水平上探讨了金匮肾气丸和右归丸的药物作用机制及其差别.
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百合科贝母属药用植物分类研究进展
对近年来关于贝母属Fritillaria药用植物的分类学研究进行了综述.贝母属药用植物的分类学主要从3个方面进行研究:根据传统的形态学特征进行分类,根据植物中的特征性化学成分进行分类,分子水平上的DNA芯片技术在基因分型和种类鉴别上的应用.通过比较发现,DNA芯片技术可为贝母属植物种属的验证与质量控制提供一种快速、高通量的检测工具,是有发展前景的用于植物种类鉴别的方法.DNA芯片技术在植物种类鉴别上的应用为分子水平上的植物分类学研究提供了理论依据.
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慢性浅表性胃炎脾虚证患者与健康人物质能量代谢基因差异表达研究
目的 分析慢性浅表性胃炎脾虚证患者体内脂类、蛋白质、糖类和核酸代谢情况,从物质能量代谢的角度探讨脾虚证的病理发生机制.方法 选择4例2004年6月-2005年3月就诊于广州中医药大学一附院和广东省中医院的慢性浅表性胃炎脾虚证患者,选择广州中医药大学健康人4名,钳取患者及健康人胃黏膜进行DNA芯片实验,利用BRB ArrayTools和IPA软件对DNA芯片双通道数据进行数据挖掘和生物信息学分析.结果 获得15个与物质能量代谢相关差异基因,占总差异表达基因(20个)的75％,其中上调基因1个,下调基因14个,11个基因为酶基因.其中脂类代谢相关差异基因有ACAA2和CYP20A1,表现为脂肪酸分解和胆固醇转化降低；蛋白质代谢相关差异基因有ALDH9A1、ASL、ASS1、PCYOX1L、RPS28、UBE2D2、UBXN1、B3GNT1、GCNT1和PPP1 R3C,表现为影响自主神经、尿素循环等生物学过程的氨基酸代谢降低,蛋白质合成降低,错误折叠蛋白泛素化降解增加,翻译后糖基化和磷酸化修饰降低；糖类代谢相关差异基因有PPP1 R3C、B3GNT1和GCNT1,表现为糖原和聚糖合成降低；核酸代谢相关差异基因有RMI1、SMARCD3和PARP1,表现为DNA复制和转录降低,DNA损伤修复增加.结论 慢性浅表性胃炎脾虚证患者体内脂类、蛋白质、糖类和核酸代谢水平明显降低,并且主要表现为酶基因表达下调,推测此可能是导致脾虚证营养代谢障碍的重要机制之一.
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慢性浅表性胃炎脾虚与脾胃湿热证患者物质能量代谢基因差异表达研究
目的 分析慢性浅表性胃炎脾虚证与脾胃湿热证患者体内脂类、蛋白质、核酸、糖类、微量元素和能量代谢情况,从物质能量代谢的角度探讨脾虚证病理发生机制.方法 选择2004年6月-2005年3月就诊于广州中医药大学第一附属医院和广东省中医院慢性浅表性胃炎患者8例,其中脾虚证和脾胃湿热证患者各4例,取两组胃黏膜进行DNA芯片实验,利用BRB ArrayTools和IPA软件对DNA芯片双通道数据进行数据挖掘和生物信息学分析.结果 获得与物质能量代谢相关且表达倍数＞2的显著差异表达基因56个,其中上调基因11个,下调基因45个.其中与脂类代谢相关的基因有CRLS1、LRP11、FUT9、GPCPD1、PIGL、SULT1A4、B3GNT1、STSSIA4和ACADVL,主要涉及脂肪酸、胆固醇、磷脂和糖脂的代谢；与蛋白质代谢相关的基因有ASR-GL1、AARSD1、EBNA1BP2、PUM2、MRPL52、C120RF65、PSMB8、PSME2、UBA7、RNF11、FBX044、ZFYVE26、CHMP2A、SSR4、SNX4、RAB3B、RABL2A、GOLGA2、KDELR1、PHPT1、ACPP、PTPRF、CRKL、HDAC7、ADPRHI2、B3GNT1、STSSIA4、DDOST和FUT9,主要涉及到蛋白质的生物合成、蛋白质泛素化、靶向输送和翻译后修饰过程；与核酸代谢相关的基因有DFFB、FLJ35220、TOP2A、SF3A3、CREB3、CRTC2、NR1D2、MED6、GTF2IRD1、C 10RF83、ZNF773和ZMYND11,主要涉及DNA复制与修复,转录调节等；与糖类代谢相关的基因有AGL、B3 GNT1、FUT9、ST8SIA4、SULT1A4、DDOST和PIGL,主要涉及糖原的分解和糖复合物的合成；与微量元素代谢相关的基因有COMMD1、SLC39A6、FTL、CHRFAM7A、SCGN和S100A6,主要涉及铜离子、锌离子、铁离子和钙离子代谢；与能量代谢相关的基因有AK3和COX7B,涉及线粒体结构和氧化磷酸化过程.结论 脾虚证患者体内脂类、蛋白质、核酸、糖类、微量元素和能量代谢水平明显降低,这可能是导致脾虚证疾病发生的重要机制.
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用酿酒酵母全基因组DNA芯片研究盐酸小檗碱的药理作用机制
目的:利用自己构建的酿酒酵母全基因组DNA芯片,分析盐酸小檗碱处理酵母细胞后对其整个基因表达谱的影响,在基因水平上分析盐酸小檗碱的药理机制.方法:用盐酸小檗碱(100μg/ml)处理酵母细胞90min后,抽提细胞的RNA进行反转录荧光标记cDNA,与DNA芯片进行杂交.用激光扫描仪检测杂交信号.结果:共有545个基因[占全部基因(6183个)的9%]受到诱导,38个基因(占全部基因的0.6%)受到抑制.被诱导的基因包括与细胞生长、蛋白质合成及应激反应相关的基因.受抑制的基因包括与氧化磷酸化过程相关的基因和好氧基因.与金属离子平衡,特别是与铁离子和铜离子平衡有关的基因表达有较大变化.结论:处理90min后,酵母细胞在转录水平上表现出对盐酸小檗碱处理的适应性.盐酸小檗碱的药理作用可能和引起细胞内的氧浓度变化及氧化还原反应产生的自由基有关.细胞容易对盐酸小檗碱产生抗药性的原因是由于与细胞抗药性相关的基因受到了明显的诱导.
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限制性显示技术制备HIV-1B亚型基因片段的研究
目前已知引起人类艾滋病(AIDS)的人类免疫缺陷病毒(HIV)有HIV-1和HIV-2两个型,其中在世界范围内流行的是HIV-1.该型已确定至少有A～J 11个亚型,而在我国则以B、C、E亚型为主[1].
关键词： 限制性显示 人类免疫缺陷病毒1型 DNA芯片 -
HRCA技术联合DNA芯片检测结核分枝杆菌利福平耐药基因突变的初步分析
目的 对超分支滚环扩增技术(hyperbranched rolling cycle amplification, HRCA)技术联合DNA芯片检测结核分枝杆菌利福平耐药基因突变进行初步分析.方法 采用直接涂片检测在2013年至2015年期间搜集的898份痰液样本中结核分枝杆菌情况,同时采用改良罗氏培养法与HRCA技术联合DNA芯片法对阳性样本进行鉴定,并对利福平耐药基因进行初步分析.结果 989份检测的痰液样本中361份为阳性,涂阳率为40.2%.HRCA技术联合DNA芯片法阳性率为98.0%,显著高于改良罗氏培养法(35.2%),且差异具有统计学意义(P<0.05).通过HRCA技术联合DNA芯片法发现85株结核分枝杆菌对利福平耐药,其中单纯rpoB 基因突变比例为36.5%(31/344);katG基因与rpoB基因均突变比例为60.0%(51/344);inhA基因与rpoB基因突变比例均为3.5%(3/344);且二位点联合突变及单位点突变率分别为89.4%(76/85)与10.6%(9/85).结论 HRCA技术联合DNA芯片法能够有效快速检出结核分枝杆菌突变基因,rpoB基因突变为主要结核分枝杆菌利福平耐药的基础,且突变呈现多样性.
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HIV-1基因限制性显示片段的制备（英文）
目的快速分离HIV-1基因片段制备DNA芯片探针. 方法以Sau3AⅠ酶切HIV基因后,将得到的限制性酶切片段两端接上接头.根据酶切位点与接头的序列设计通用引物.在该通用引物的3'端分别延伸1个碱基后,通过引物间的两两组合,将PCR反应分成10个亚组.纯化各组PCR产物,克隆到T载体上.挑取白色菌斑进行快速鉴定后扩大培养阳性克隆、提质粒.以质粒为模板扩增靶片段并测序. 结果每个亚型得到了十几个100～1 000 bp的HIV基因片段. 结论限制性显示技术是一种有效的快速分离制备基因片段的方法.
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微量核酸样品的双重限制性荧光标记技术
目的 采用双重限制性荧光标记技术(double restriction fluorescent labeling,DRFL),标记微量核酸样品,探索提高基因芯片用于病原体检测的灵敏度.方法 以限制性显示技术处理SARS-CoV核酸样品,分别采用传统限制性荧光标记技术(直接采用荧光标记的通用引物标记)和双重限制性荧光标记技术(荧光标记的通用引物和荧光标记的dNTP的双重荧光标记)进行处理,并进一步与基因芯片进行杂交,在同等条件下进行杂交、清洗和进行基因芯片的扫描检测.通过对杂交结果的分析,比较两种标记方法的标记效果.结果 以DRFL方法标记SARS基因片段,其荧光强度均值提高了3.5835倍,但互相对应的每个探针之间的荧光信号提高程度存在差异.结论 DRFL技术能有效地提高单位分子标记片段的荧光强度值,并进一步提高了检测的灵敏度,可用于微量病原体核酸样品的基因芯片检测.
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DNA条形码识别Ⅲ.媒介蚊类DNA条形码芯片的初步研究
目的 利用DNA条形码信息研制DNA芯片,建立快速高效的医学媒介蚊类鉴定方法.方法 以蚊科5属15种,共30个样本为研究材料,获取其DNA条形码信息(CO Ⅰ基因片段序列),采用基因块motif技术,搜索15个样本的同源保守基因序列,制作虚拟DNA条形码芯片.虚拟电子杂交30个样本,应用软件Bio-Edit计算属、种及种内个体间的同一性,应用phylip 3.66软件以大简约法分别对杂交结果和原序列进行聚类分析比较.结果 选择78个DNA片段制作一张虚拟DNA条形码芯片,计算属间的平均同一性为0.75,同一属内种间的平均同一性为0.84,种内个体间的平均同一性为0.98,聚类分析结果一致.结论 研制的虚拟DNA芯片能够鉴定本研究中的15种蚊虫,利用DNA条形码信息,设计DNA芯片在理论上可行.
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干扰素-α对K562细胞基因表达谱的调控研究
本研究查明干扰素-α对K562细胞基因表达谱的调控作用,为阐明IFN-α治疗慢性髓性白血病的作用机制提供依据.应用DNA芯片技术对IFN-α作用前后K562细胞基因表达谱的变化进行检测.结果表明:200 U/ml的IFN-α作用K562细胞1天后,没有1个基因表达差异在2.5倍以上,随后逐渐增多,到4天时达到高峰,在检测的基因中共有97个表达差异显著的基因,其中84个(86.60%)上调,13个(13.4%)下调.在97个表达差异显著的基因中,细胞调节蛋白类占23.71%,细胞受体类占14.43%,癌基因与抑癌基因占11.34%,细胞信号传导蛋白类占9.28%,细胞黏附分子占8.25%,其它基因占32.99%.第5天开始下降,但到第21天时仍有9个表达差异显著的基因.在细胞信号传导蛋白类中,参与JAK-STAT途径的JAK1基因经IFN-α刺激4天上调到3.78倍,JAK2上调到15.43倍.同时还发现信号转导子及转录活化子STAT1及STAT2分别上调到11.98和8.11倍.结论:IFN-α在浓度200 U/ml时,对K562细胞作用4天其基因表达变化显著;IFN-α对K562细胞基因表达的调控是通过调节JAK-STAT途径实现的,此途径可能是FN-α治疗CML的机制之一.
