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人肠道病毒71型高致病性毒株及其体外适应株cDNA感染性克隆的构建
高致病性EV71毒株的感染易伴发神经系统症状,是导致手足口病死亡病例的主要原因,但目前临床上仍缺乏防治EV71感染的特效药物及安全有效的疫苗.为进一步明确EV71的致病机制,本项工作以高致病性的EV71-HP临床分离株及其经体外细胞培养适应的EV71-CCA毒株的基因组RNA为模板,应用反向遗传学方法构建了二者的感染性克隆.研究表明HP株在细胞中的增殖速度明显快于CCA株.两株基于感染性克隆的拯救病毒分别保持了与各自母本株基因组序列的一致性,同时也保留了母本株增殖表型的差异,包括病毒的增殖速度以及病毒的温度敏感性.本工作将促进对EV71的致病机制以及对EV71疫苗的研究.
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猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4-F112弱毒株NSP2区表达猪瘟病毒E2基因表位的研究
建立共表达猪瘟病毒(Classic swine fever virus,CSFV) E2蛋白主要中和性抗原表位基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)反向遗传操作平台,为进一步研究PRRSV作为病毒载体提供实验数据.本研究在PRRSVHuN4-F112疫苗株感染性分子克隆的基础上,采用突变PCR技术将CSFV E2蛋白的主要中和性抗原表位基因插入HuN4-F112弱毒株PRRSV已鉴定出的两个NSP2蛋白的复制非必需区,经基因片段的克隆、拼接,构建了两株含有CSFV E2蛋白的主要中和性抗原表位基因的感染性PRRSV cDNA克隆psk-HuN4-F112-Δ508-532+ E2和psk-HuN4-F112-Δ480-532+ E2.用限制性内切酶Swa Ⅰ分别将两株共表达的感染性克隆线性化,之后通过细胞外转录获得病毒RNA,用脂质体法分别将病毒RNA转染BHK-21细胞包装出病毒粒子,再分别将其转接到MARC-145细胞传代拯救出两株病毒.分别对两株拯救病毒进行RT-PCR扩增、酶切和序列分析鉴定.结果表明,两株拯救病毒含有不同于亲本病毒的分子标记(拯救病毒基因组的14 667位因同义突变产生的MluⅠ酶切位点)和插入基因序列.间接免疫荧光试验表明,CSFV E2蛋白主要中和性抗原表位基因均能在两株拯救的PRRSV中表达,且能够在其传代过程中稳定遗传.病毒生长特性结果比较显示两株拯救病毒与亲本病毒在MARC-145细胞上具有相似的增殖特性.本研究构建了两株共表达CSFV E2蛋白主要中和性抗原表位基因的PRRSV感染性克隆并获得了拯救病毒,且外源基因能在拯救病毒中稳定表达,为进一步开发新型PRRSV二联疫苗提供了有效的反向遗传操作平台.
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 感染性cDNA 拯救病毒 病毒载体 -
EV71济南分离株感染性克隆的构建及其生物学特征分析
目的 构建以济南本土分离株为模板的EV71感染性克隆,转染细胞以获得拯救病毒并观察其生物学特性,为研究EV71病毒基因结构和功能奠定基础. 方法 分段扩增EV71基因组cDNA并顺序连接至pCDNA3.1载体,同时在序列两端引入自剪切核酶序列,构建能直接转染细胞的病毒基因组全长cDNA克隆,转染RD细胞后获得拯救病毒.通过噬斑形成试验、间接免疫荧光试验和感染性滴度测定观察拯救病毒的生物学特征. 结果 成功构建了病毒基因组全长cDNA克隆,转染RD细胞后观察到典型细胞病变,收获的病毒经RT-PCR扩增出特异性目的片段,全序列测定结果表明拯救病毒与父本株相比具有3个同义突变,未导致推导氨基酸的变异;拯救的子代病毒感染RD细胞后形成典型的空斑;间接免疫荧光试验检测拯救病毒感染细胞可见特异性荧光,荧光密度较父本株病毒稍弱;拯救病毒传代稳定,其感染性滴度(103.48)较父本株(10-5.0)稍低. 结论 成功构建了真核载体的病毒全长cDNA感染性克隆,拯救病毒与野生株具有相似的生物学性状和感染性.
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基因体外转录的应用研究
大量研究表明,基因表达的调控发生在基因复制、转录、转录后、翻译和翻译后等环节上.而基因转录的调控是逐级调控中关键的环节.由于参与调控的因素有很多,调控的过程非常复杂,因此在体内自然条件下,对基因的转录情况进行研究比较困难.
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反向遗传学技术及其应用
反向遗传学是直接从遗传物质入手来研究生命现象与规律的,其相应的操作技术已在生命科学研究的各个领域显示出了广泛的应用前景.文章从拯救病毒和创造新型病毒、负股RNA病毒的研究、动植物基因功能的研究以及利用RNA干扰使基因沉默等方面,对反向遗传学技术的应用进行了评述,并对其前景进行了阐述.
