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一种肠道病毒D68型感染性克隆的构建方法
目的 构建肠道病毒D68型(EV-D68)cDNA感染性克隆. 方法 利用聚合酶不完全引物延伸(Polymerase Incomplete Primer Extension,PIPE)法分别扩增EV-D68基因组cDNA片段与pBR322载体,得到的片段连接后测序,连接产物测序正确后作为载体与EV-D68的基因组的第2段扩增连接.以此类推,边扩增边连接,并测序,直到全基因组全部连接到pBR322上,在EV-D68基因组前面插入T7启动子后,经体外转录后的RNA转染RD细胞,转染后显微镜下连续观察是否出现细胞病变,并利用EV-D68的VP1特异性抗体进行免疫印迹确认. 结果 转染后24 h在显微镜下可以观察到典型的肠道病毒细胞病变,病变细胞裂解液的免疫印迹得到特异的EV-D68的VP1条带,这些结果显示包装出EV-D68病毒,这些包装的病毒经传代实验显示可以连续传代. 结论 成功构建EV-D68 cDNA感染性克隆.
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黄病毒的感染性克隆和嵌合突变体
感染性克隆技术已广泛应用于深入阐明黄病毒致病机理、构建病毒载体等研究领域,其中利用感染性克隆构建嵌合突变体是黄病毒疫苗研究中很有希望的新途径.本文就该研究的新进展作一简要综述.
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冠状病毒全长cDNA感染性克隆研究进展
冠状病毒是已知RNA病毒中基因组大的一类病毒,其基因组复制不涉及DNA中间体,所以要进行病毒分子水平上的研究,必须将病毒基因组RNA转换成cDNA,然后构建出cDNA克隆,通过对cDNA克隆的操作间接实现对病毒基因组RNA的操作,从而为冠状病毒基因组研究提供易于操作的技术平台,大大提高了病毒的研究潜力.本文就构建冠状病毒基因组全长cDNA感染性克隆的新进展做一综述.
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人肠道病毒71型高致病性毒株及其体外适应株cDNA感染性克隆的构建
高致病性EV71毒株的感染易伴发神经系统症状,是导致手足口病死亡病例的主要原因,但目前临床上仍缺乏防治EV71感染的特效药物及安全有效的疫苗.为进一步明确EV71的致病机制,本项工作以高致病性的EV71-HP临床分离株及其经体外细胞培养适应的EV71-CCA毒株的基因组RNA为模板,应用反向遗传学方法构建了二者的感染性克隆.研究表明HP株在细胞中的增殖速度明显快于CCA株.两株基于感染性克隆的拯救病毒分别保持了与各自母本株基因组序列的一致性,同时也保留了母本株增殖表型的差异,包括病毒的增殖速度以及病毒的温度敏感性.本工作将促进对EV71的致病机制以及对EV71疫苗的研究.
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鹅圆环病毒感染性克隆的构建及其转染试验
设计带BamHⅠ酶切标记位点的引物,PCR扩增鹅圆环病毒(Goose circovirus,GoCV)全长基因组,将2个基因组顺式连接插入到pGEM-T Easy载体中,获得GoCV全长基因组头尾串联二聚体感染性克隆质粒pGEMT2GoCV.EcoR Ⅰ酶切线性化pGEMT-2GoCV,与脂质体混合转染GoCV阴性鹅胚和雏鹅,常规PCR检测发现GoCV在转染鹅体内增殖,鹅胚转染组于孵出第2周和第4周检出血清阳性,且其中一个个体于4周龄扑杀时检出法氏囊阳性,雏鹅转染组于转染后2周检出血清阳性.试验进一步对扩增片段进行了BamH Ⅰ标记位点的检测,并应用GoCV实时荧光定量PCR方法对转染阳性样品进行了定量,结果显示阳性法氏囊组织中病毒含量为1.57×106拷贝/mg,阳性血清含病毒拷贝数在3.52×104～5.92×105拷贝/μL.综上,本试验构建的GoCV全长基因组头尾串联二聚体感染性克隆DNA可以转染鹅胚和雏鹅并增殖出带标记的GoCV克隆.
关键词： 鹅圆环病毒 全长基因组头尾串联二聚体 感染性克隆 转染 -
中国株EIAV S2基因逆向突变感染性克隆的构建及体外感染性评价
以中国株EIAV的驴强毒株EIAVDV115与疫苗株EIAVFDDV15的S2基因变化规律为依据,利用反向遗传技术对EIAV弱毒疫苗株全基因组感染性克隆pFDDV3-8的S2基因区进行逆向突变,构建了含有强毒株EIAVDV115S2基因区内4个稳定点突变的克隆质粒pFDDVS2r1-3-4-5,将该质粒转染FDD后进行体外继代肓传,经RT-PCR、逆转录酶活性、间接免疫荧光等检测后,显示经EIAV克隆质粒pFDDVS2r1-3-4-5转染的FDD盲传3代后,可在转染的FDD细胞培养物的上清液中检测到EIAV逆转录酶活性;该细胞培养物经RT-PCR和间接免疫荧光检测均呈EIAV阳性;在电镜下可观察到典型EIAV粒子.证明已成功拯救经EIAV S2基因逆向突变后的衍生病毒vpFDDVS2r1-3-4-5.比较vpFDDVS2r1-3-4-5衍生病毒与亲本克隆衍生病毒的复制动力学,表明前者的复制比后者略滞后.以上结果提示,对疫苗株S2 基因的突变未明显影响EIAV的体外复制.
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乙脑/登革2型嵌合病毒的构建
在乙脑病毒SA14-14-2株复制子载体pPartial△prM/E中克隆入DV2(Dengue virus serotype z)的prM/E基因,构建乙脑/登革2型嵌合体克隆.将嵌合体克隆线性化后体外转录,获得的RNA转染BHK-21细胞,5～7d可观察到CPE.收获病毒上清液分别感染BHK-21细胞及C6/36细胞.接种于C6/36细胞中的嵌合病毒可使细胞出现CPE,RT-PCR、间接免疫荧光和Western blot检测显示:获得的嵌合病毒具有预期嵌合性核酸并能表达DV2的包膜蛋白,但不能在BHK-21细胞中传代培养.成功构建的乙脑/登革2型感染性克隆为进一步研究登革病毒疫苗奠定了基础.
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流行性乙型脑炎病毒(JEV)全长感染性克隆的制备及恢复病毒的获得
根据JEV病毒减毒株SA14-14-2基因组序列,设计覆盖全长的4对重叠引物,以提取的活疫苗病毒RNA为模板,RT-PCR扩增出4 个片段,并克隆到质粒载体中,进一步构建两个半端分子克隆,然后将全长cDNA序列克隆到一个新改造的低拷贝质粒载体pBR-kpn中,构建我国流行性乙型脑炎病毒(JEV)基因组全长cDNA克隆.经过体外转录后得到的转录子转染B H K-21细胞,重新获得JEV的恢复病毒,通过生物学特性、分子生物学水平、蛋白水平等几个方面对恢复病毒进行鉴定.结果获得了稳定的全长cDNA克隆,转录子转染B HK-21细胞后,第4天开始出现细胞病变(CPE),第6～7天时CP E为?P,经过Vero细胞进一步放大培养后,间接免疫荧光实验和RT -PCR实验均为阳性.证实了构建的JEV的全长cDNA克隆有感染性,为进一步的研究奠定了基础.
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感染性马传染性贫血病毒嵌合克隆的构建
在已有的全长感染性克隆pFD3的基础上,构建了新的低拷贝的全长克隆pLGFD3-8.按照疫苗制备过程中env基因的变化情况,采用基因替换和定点突变的方法,构建了一系列具有马传染性贫血病毒(EIAV)强毒株env基因及其主要突变特征的嵌合克隆.利用这些克隆转染FDD细胞,并用逆转录酶活性检测和PCR方法确定其感染性.结果发现,在FDD细胞中传代3次后,可在细胞培养物中检测到逆转录酶活性和原病毒DNA的存在,在电镜下可以观察到典型的EIAV病毒颗粒.这一结果为进一步研究马传染性贫血病毒致病的分子机制和免疫保护机理奠定了良好的基础.
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利用Gibson DNA组装技术构建人5型腺病毒感染性克隆
为了构建人5型腺病毒 (HAdV-5) 的感染性克隆, 我们使用了Gibson DNA组装技术.设计1对引物用于扩增质粒骨架 (包含卡那霉素抗性基因和质粒的复制起点, KAN-ORI), 在引物的5'端添加HAdV-5基因组末端序列 (约30NT) 和Pac I位点, 以携带卡那霉素抗性基因的pShuttle-CMV质粒为模板, PCR扩增得到KAN-ORI片段, 该片段的两端均含有约30bp的HAdV-5基因组序列.将KAN-ORI片段与利用野毒扩增纯化的HAdV-5基因组混合, 进行Gibson DNA组装反应;反应产物直接转化E.coli感受态细胞, 涂布含卡那霉素的LB琼脂平板.挑取菌落, 提取质粒, 命名为pKAd5.限制性酶切鉴定的结果显示, 所鉴定的质粒均含有完整的HAdV-5基因组.使用Pac I酶切线性化pKAd5, 利用脂质体转染293细胞, 转染4d后单层细胞出现病毒噬斑.拯救的病毒能够在Hep-2细胞扩增;电子显微镜观察呈现典型的腺病毒形态;提取病毒DNA, 酶切鉴定的结果与预期的HAdV-5基因组相同, 证实HAdV-5得到成功拯救.上述研究结果说明使用Gibson DNA组装技术构建HAdV-5感染性克隆简便易行, 为其他DNA病毒基因组的克隆提供了新思路.
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肠道病毒71型的全长cDNA感染性克隆的构建与鉴定
目的 构建一株肠道病毒71型的全长cDNA克隆并验证感染性.方法 用长片段高保真RT-PCR方法扩增肠道病毒71型87-2008 Xi'an株的cDNA,装入pBR322载体.将该克隆线性化,体外转录后转染RD细胞后,通过观察CPE及RT-PCR验证其感染性.随后利用空斑法测定拯救病毒的一步生长曲线.结果 成功构建了肠道病毒71型87-2008 Xi'an株的全长cDNA克隆；体外转录及转染RD细胞60 h后可观察到明显的CPE现象；RT-PCR在转染RD细胞中检测到病毒的存在；成功利用空斑法测定了拯救病毒的一步生长曲线,大滴度达到2×107 pfu/mL.结论 成功构建了肠道病毒71型87-2008 Xi'an株的全长cDNA克隆并验证了其感染性,同时测定了拯救病毒的一步生长曲线,与野生型病毒相近.
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乙脑病毒野毒株SA14感染性克隆的构建及病毒拯救
目的 构建乙脑病毒野毒株SA14感染性克隆并进行病毒拯救. 方法 分节段合成乙脑病毒野毒株SA14全长cDNA序列,采用分段连接方式构建SA14全长cDNA质粒,以其为模板体外转录RNA并电转染导入BHK21细胞进行病毒拯救,用噬斑试验和间接免疫荧光法鉴定拯救病毒;绘病毒生长曲线,测定拯救病毒对小鼠的神经毒力. 结果 酶切鉴定质粒模板成功构建,用免疫荧光法检测到恢复病毒包膜蛋白表达,噬斑实验发现乙脑野毒株噬斑直径大于疫苗株;绘制病毒生长曲线,野毒株和疫苗株均在60 h达到高峰.用拯救病毒进行动物感染试验,野毒株对小鼠脑内神经毒力LD50为10-1.07,皮下神经毒力LD50为100.33. 结论 成功建立乙脑野毒株SA14感染性克隆并拯救病毒,为进一步研究乙脑病毒的致病机制等奠定了基础.
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反向遗传学在轮状病毒研究中的应用
针对病毒的反向遗传技术可以在基因水平上对病毒基因组进行各种修饰或改造,通过观察病毒的表型变化来判断这些基因操作的效果,从而达到研究病毒及其致病机制的目的.反向遗传技术在RNA病毒的研究中应用广泛,借助反向遗传技术调控病毒基因表达、揭示病毒蛋白功能已较为普遍,尤其是通过基因操作人工“合成”病毒的感染性克隆一直是近年来反向遗传学研究的热点领域.目前轮状病毒的反向遗传操作仅限于借助辅助病毒实现部分基因节段的修饰和替换,尚没有拯救完整病毒的报道.本文就反向遗传技术在RNA病毒拯救,特别是轮状病毒研究中的应用与进展作一简要综述.
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携带绿色荧光蛋白报告基因的HCoV-OC43感染性克隆的构建与病毒拯救
目的：探索利用HCoV-OC43感染性克隆表达外源基因的可行性及插入区域。方法在HCoV-OC43全长感染性克隆pBAC-OC43 FL的基础上,利用融合PCR和酶切连接等方法,成功构建了在3个不同位置插入绿色荧光蛋白报告基因( GFP替换 NS2基因或NS12.9基因以及插入N基因后)的重组质粒,利用反向遗传学操作技术进行病毒拯救,通过免疫荧光、Western blot和病毒感染等试验对重组病毒进行鉴定分析。结果 GFP替换NS2或NS12.9基因的感染性克隆可以成功拯救出重组病毒(OC43-GFPΔNS2和OC43-GFPΔNS12.9),其中OC43-GFPΔNS2在感染BHK-21细胞后能够观察到GFP基因的高效表达,OC43-GFPΔNS12.9在感染细胞后仅有少量GFP基因的表达,而GFP插入N基因后的感染性克隆未能拯救出病毒。结论 NS2基因可以作为HCoV-OC43感染性克隆表达外源基因的插入位点,并且外源基因插入至该位点可获得稳定高效表达,为进一步研究HCoV-OC43的复制规律及研发基于HCoV-OC43的冠状病毒载体提供了参考依据。
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黄病毒属病毒的感染性克隆研究进展
黄病毒科包括了一大类人和动物的病毒性病原体,这些病毒均为包膜的单股正链RNA病毒,目前分三个属:经典的黄病毒属、瘟病毒属和丙型肝炎病毒属.每个属中病毒的感染性cDNA遗传学研究都使人们进一步了解病毒复制和致病性原理.对RNA病毒进行反向遗传学研究的历史,可追溯到20多年前,1978年Taniguchi首次从cDNA克隆获得了RNA噬菌体Qβ[1],1981年通过脊髓灰质炎病毒cDNA首次获得动物病毒的感染性克隆[2],从此对正链RNA病毒的反向遗传学研究系统逐步完善起来了.随后,对负链RNA病毒、分节(流感病毒)和不分节(狂犬病毒)的cDNA感染性克隆研究也获得成功.近对双链RNA病毒的反向遗传学研究也有了突破,至此,对RNA病毒的反向遗传学研究已涵括了大部分的RNA病毒.这些研究结果为疫苗开发研制提供了新途径.本文就黄病毒属病毒感染性克隆研究的技术方法和进展作一综述.
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携带脑组织特异性microRNA靶序列的重组日本脑炎病毒的构建与鉴定
目的 构建携带脑组织特异性miRNA靶序列的重组日本脑炎病毒株.方法 利用反向遗传学技术将脑组织特异性的miR-124和miR-125靶序列引入日本脑炎病毒cDNA全长感染性克隆,将重组质粒用Xho Ⅰ线性化后采用SP6转录试剂盒进行体外转录,以获得的RNA转染BHK-21细胞,37℃、5％CO2孵箱培养3d后取上清盲传1代观察细胞病变,并通过RT-PCR、细胞蚀斑形成实验和病毒生长曲线等方法对恢复病毒的生物学特性进行鉴定.结果 成功在BHK-21细胞中拯救获得了携带miRNA靶序列的重组病毒,与野生型病毒株具有相似的蚀斑形态和生长特性.结论 通过反向遗传学技术获得了携带脑组织特异性miRNA靶序列的重组日本脑炎病毒,为miRNA介导的组织特异性减毒机制研究奠定了基础.
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柯萨奇病毒A组16型cDNA感染性克隆的构建
目的 构建柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CA16)cDNA感染性克隆.方法 提取CA16基因组RNA,经RT-PCR得到基因组全长cDNA,插入至TOPO-XL-PCR载体,获得CA16全长cDNA克隆.采用T7聚合酶系统将线性基因组cDNA体外转录出病毒基因组RNA,纯化后转染Vero细胞,获得拯救病毒.通过RT-PCR、基因测序及免疫荧光法对拯救病毒进行鉴定,并对拯救病毒与母本病毒的增殖特性进行比较.结果 病毒基因组RNA转染Vero细胞后48 h,可见典型的肠道病毒致细胞病变.拯救病毒经RT-PCR、基因测序和免疫荧光鉴定为CA16,且与母本野生型病毒增殖特性基本一致.结论 成功构建了具有感染性的CA16全长cDNA克隆,为研究CA16基因功能和研发CA16新型疫苗奠定了基础.
关键词： 柯萨奇病毒A组16型 感染性克隆 病毒拯救 -
分子生物学技术在黄病毒属病毒疫苗研制中的应用及该类疫苗的研究进展
黄病毒科黄病毒属包括70多种病毒,其中约40多种与人类疾病相关,大部分为虫媒病毒.其中对人类致病的重要病原主要有登革病毒、乙型脑炎病毒、黄热病毒、蜱传脑炎病毒等.分子生物学技术的发展为黄病毒属病毒疫苗的设计带来了新的策略.本文对当前分子生物学技术如感染性克隆技术在黄病毒属病毒疫苗研制中的应用以及嵌合疫苗、蛋白亚单位疫苗和DNA疫苗的研究进展作一综述.
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长模板聚合酶链反应技术在病毒学研究中的应用
长模板聚合酶链反应(PCR)技术是一种可扩增几个kb甚至几十个kb基因片段的PCR新技术,已被用于病毒全长基因,感染性克隆的构建,转录体的制备,病毒基因变异、分型的分析和病毒基因功能组学的研究等方面.
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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆的构建
目的 确定"猪高热综合征"的主要病原是否为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),为探寻高致病性病毒基因组结构和功能、高致病性蓝耳病发病机制,以及进一步研制针对后者的基因工程疫苗奠定基础.方法 根据PRRSV基因组序列设计特异性引物,分5段扩增了高致病性PRRSV JX143株的全长cDNA,将各cDNA片段克隆到pBlueScript Ⅱ SK(+)载体中,进而利用重叠区中的单酶切位点将其连接成JX143株的全长cDNA克隆pJX143和含有遗传标记Mlu Ⅰ限制性内切酶的基因组全长cDNA克隆pJX143.M.结果 全长cDNA克隆经体外合成RNA后转染MA-104细胞,均获得稳定的拯救病毒.通过比较亲本病毒与拯救病毒的病毒滴度、多步生长曲线和利用拯救病毒vJXi43进行动物回归试验,结果发现病毒学及生物学特性没有显著差异.结论 PRRSV的JX143株病毒确实是引起"猪高热综合征"的主要病原;建立了首个高致病性PRRSV的感染性cDNA克隆,证明拯救病毒与亲本病毒生物学特性相同.
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 感染性克隆 高致病性 动物回归试验
