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传统DNA疫苗载体与Semliki森林病毒复制子对HIV-1 Pr55gag表达与体液免疫原性的比较性研究
为探索Semliki森林病毒(SFV)衍生的复制型DNA载体可否用于HIV疫苗的候选载体,对该载体与传统DNA疫苗载体对HIV-1Pr55gag的表达与体液免疫原性进行了系统比较研究.将野生型(wtgag)及密码子改造(syngag)的HIV-1 ⅢB gag基因分别克隆于SFV DNA载体及传统DNA疫苗载体[pCDNA3.1(+)],对其Pr55gag细胞内表达水平、Pr55gag病毒样颗粒释放、以及在BALB/c鼠的体液免疫原性进行了比较.在293T、H1299、C2C12和BHK细胞系中,SFV-wtgag可以Rev非依赖方式有效表达Pr55gag,而pC-wtgag转染的细胞不能有效表达Pr55gag,从而不能诱导小鼠产生免疫反应.虽然SFV质粒的细胞转化效率明显低于pCDNA载体,SFV-wtgag和SFV-syngag在细胞内Pr55gag的表达量与pC-syngag相似,而Pr55gag病毒样颗粒的释放明显低于pC-syngag.在肌内注射免疫的小鼠中,低剂量(0.1和1.0μg)的SFV及pCDNA gag表达质粒均未诱导出GAG特异性免疫反应.在高剂量(10,30,100μg)免疫组中,与SFV gag表达质粒相比,pC-syngag可诱导出较高水平的TH1型GAG特异性抗体.SFV-syngag较SFV-wtgag可诱导出高水平的体液免疫反应.结果提示,SFV衍生的复制子单独使用不能在小鼠诱导出优于传统DNA疫苗载体的HIV-1 GAG特异性体液免疫反应,其原因可能与病毒样颗粒的释放有关.密码子改造的gag基因的优势在SFV载体系统中得到了进一步证实.
关键词： HIV-1 Semliki 森林病毒 DNA 疫苗 表达 免疫原性 -
日本血吸虫组织蛋白酶B DNA疫苗与IL-4真核表达质粒联合免疫诱导小鼠保护性的研究
目的观察日本血吸虫组织蛋白酶B DNA疫苗与IL-4真核表达质粒联合免疫小鼠的效果. 方法将小鼠IL-4 基因PCR扩增片段克隆入真核表达载体pcDNA3以构建重组表达质粒.小鼠分为4组, 每组12只,实验组(A)每鼠肌注组织蛋白酶B DNA疫苗和IL-4表达质粒各100 μg,同时设立组织蛋白酶B DNA疫苗对照组(B)、IL-4表达质粒对照组(C)和空载体对照组(D),共免疫3次.2周后用免疫组化检测表达质粒在小鼠肌细胞的表达,3周后经皮肤攻击感染小鼠40±1条日本血吸虫尾蚴.计算减虫和减卵率,观察免疫保护性. 结果重组IL-4质粒和组织蛋白酶B DNA疫苗均在小鼠肌细胞表达.用重组IL-4质粒和组织蛋白酶B DNA疫苗联合免疫诱导小鼠产生43.20% 的减虫率和76.63% 的减卵率,与组织蛋白酶B DNA疫苗单独免疫比较差异均有显著性(P<0.001,P<0.05). 结论联合IL-4表达质粒免疫可能提高日本血吸虫组织蛋白酶B DNA疫苗的抗血吸虫保护性免疫.
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分子生物学技术在黄病毒属病毒疫苗研制中的应用及该类疫苗的研究进展
黄病毒科黄病毒属包括70多种病毒,其中约40多种与人类疾病相关,大部分为虫媒病毒.其中对人类致病的重要病原主要有登革病毒、乙型脑炎病毒、黄热病毒、蜱传脑炎病毒等.分子生物学技术的发展为黄病毒属病毒疫苗的设计带来了新的策略.本文对当前分子生物学技术如感染性克隆技术在黄病毒属病毒疫苗研制中的应用以及嵌合疫苗、蛋白亚单位疫苗和DNA疫苗的研究进展作一综述.
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日本血吸虫双价DNA疫苗的构建及其免疫保护性研究
目的研究防治日本血吸虫病的双价DNA疫苗的免疫保护效果.方法构建共表达双价DNA疫苗pVI-VO2-mcs-SjFABP-Sj23和pVIVO2-mcs-Sj23-SjFABP,并用BamHI/EcoRI和BspHI/AvRⅡ进行双酶切和测序鉴定.通过免疫荧光法(IFAT)检测质粒在BALB/c小鼠骨骼肌细胞的表达.70只小鼠随机分为7组,每组10只,分别肌肉注射生理盐水、pVIVO2-mcs、pVIVO2-mcs-Sj23、pVIVO2-mcs-SjFABP、pVIVO2-mcs-Sj23-SjFABP、pVIVO2-mcs-SjFABP-Sj23和pVIVO2-mcs-Sj23-SjFABP+多糖佐剂,免疫1次.免疫后4周用40±2条尾蚴攻击感染,感染后45 d剖杀,计数各组小鼠成虫数和肝虫卵数.结果双酶切反应和测序分析证明成功构建双价质粒DNA.IFAT结果提示双价质粒DNA可在小鼠骨骼肌细胞胞膜和胞浆中表达.双价DNA疫苗免疫小鼠后获得41.2%～53.8%的减虫率和47.0%～53.8%肝减卵率;pVIVO2-Sj23-SjFABP+多糖佐剂组获得68.9%的减虫率和84.0%肝减卵率,保护力显著高于单价疫苗和双价疫苗(P＜0.05).结论共表达的双价DNA疫苗在小鼠体内可产生较好的抗血吸虫感染的免疫保护效果.多糖佐剂组保护效果明显高于单价和双价疫苗组.
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编码流感病毒血凝素基因和CD40L的核酸疫苗抗小鼠流感研究
为了检测表达CD40L的质粒能否作为核酸疫苗佐剂提高A/PR8/34流感病毒血凝素(HA)DNA疫苗的免疫应答,构建了表达鼠CD40L的质粒,并将它与A型流感病毒的 HA DNA疫苗用电击的方法共同免疫BALB/C小鼠(各30μg),免疫两次,间隔三周,第二次免疫后1周,用致死量流感病毒A/PR8/34攻击.发现与单独免疫30μg HA相比,血清中抗HA的IgG抗体量明显提高,且以IgG2a抗体提高为主,小鼠体重减轻非常少且体重恢复加快.实验结果显示,CD40L能作为流感病毒核酸疫苗佐剂,提高小鼠抗流感病毒攻击的能力.
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梅毒螺旋体外膜蛋白Gpd在Hela细胞中的表达及鉴定
目的构建梅毒螺旋体(Tp)外膜蛋白甘油磷酸二酯磷酸二酯酶基因(Gpd)的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Gpd,鉴定其在Hela细胞的表达,为开展Tp DNA疫苗动物实验打下基础.方法用PCR从Tp Nichols株基因组中扩增Gpd基因,构建真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)-Gpd,脂质体介导转染入Hela细胞,以免疫组化及Western -blot检测在Hela细胞中的表达.结果双酶切及DNA测序显示重组质粒含有1 059 bp的目的基因片段,读码框架正确,无突变.该重组质粒在Hela细胞能有效表达分子量为41 kDa的目的蛋白,重组蛋白能与梅毒螺旋体阳性血清反应.结论构建的质粒pcDNA3.1(+)-Gpd成功地在体外真核细胞中表达.
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屋尘螨过敏原DNA疫苗对哮喘模型小鼠Foxp3+调节性T细胞功能的影响
目的 观察编码屋尘螨主要过敏原Der p1和Der p2的质粒DNA疫苗对哮喘小鼠脾细胞Foxp3+调节性T细胞(regulatory T cells,Treg细胞)功能的影响.方法 以屋尘螨提取液复制哮喘模型后,将编码Der p1、Der p2的真核表达质粒pDs-Der p1、pCI-neo-Der p2等量混合接种小鼠后对小鼠进行再次激发.分离小鼠脾脏细胞,以流式细胞仪方法检测CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例.采用磁珠法分离CD4+CD25+T细胞,流式细胞仪检测其Foxp3基因的表达,并以IL-2进行刺激观察其增殖反应,测定其上清液中的IL-10、TGF-β含量.将分离的Treg细胞与哮喘小鼠CD4+CD25-T细胞共同培养,观察Treg细胞对CD4+CD25-T细胞增殖及IL-4、IL-5、IFN-γ的影响.结果 哮喘组小鼠脾脏CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例显著低于对照组,经DNA疫苗治疗后CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞显著增加.体外培养发现各组CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞增殖能力均显著低于CD4+CD25-T细胞,培养液上清中均未检测到IL-10和TGF-β存在.3组CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞均可显著抑制哮喘CD4+CD25-T细胞的增殖及IL-4、IL-5和IFN-γ的分泌,但在3组Treg细胞中,哮喘组Treg细胞作用显著低于其他两组.结论 Treg细胞可显著抑制哮喘CD4+CD25-T细胞的增殖及炎性介质的分泌,哮喘小鼠不仅出现CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞数量的减少,而且其功能也可能出现缺陷.DNA疫苗治疗可以诱导CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞增加,并恢复其功能活性.
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DNA疫苗与CTL
强力有效的免疫策略对一些疾病如感染性疾病和肿瘤等是迫切需要的,而传统途径和分子免疫途径到目前为止并没有取得太大的成功.近关于不同T细胞亚群的作用的研究使得解决这个问题有了一个更加合理的途径.现在已知,对多种感染性疾病特别是病毒感染如人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)的感染以及肿瘤的防治需要产生强有力的细胞介导的免疫反应(Cell-mediated immunity,CMI).
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结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因疫苗的免疫效果观察
目的: 研究并比较结核分枝杆菌(H37Rv)Ag85B、MPT64 DNA, 以及两者的融合基因(AM)的免疫原性.方法: 雌性C57BL/6小鼠25只, 随机分为5 组, 即A组(PBS)、B组(pcDNA3.1)、C组(pcDNA/Ag85B)、D组(pcDNA/MPT64)和E组(pcDNA/AM).分别于胫前肌注射7.5 g/L利多卡因和质粒混合物(1∶ 4, 100 μL, 含质粒70 μg/次), 间隔2 wk免疫1次, 共3次.末次免疫后4 wk取血分离血清测定总IgG, 同时分离脾淋巴细胞, 用PPD刺激后分别做脾淋巴细胞增殖实验(MTT比色法)和测定脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ的水平.结果: Ag85B、MPT64和AM质粒DNA, 均能诱导小鼠产生较高水平的PPD特异性IgG.免疫小鼠脾淋巴细胞体外经PPD刺激后, 能产生特异性淋巴细胞增殖和分泌IFN-γ.pcDNA/AM组IFN-γ的分泌水平明显高于pcDNA/Ag85B和pcDNA/MPT64免疫组(P<0.05).结论: 结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因疫苗, 能在小鼠体内诱导特异性细胞和体液免疫.
