首页 > 文献资料
-
Ag85B与MPT64 DNA疫苗联合免疫对鼠结核分枝杆菌感染的保护作用
目的研究Ag85B与MPT64 DNA疫苗联合免疫对鼠结核分枝杆菌感染的免疫保护效果.方法 C57BL/6小鼠54只,采用随机数字表法随机分为6组, 分别用磷酸盐缓冲液(PBS)、pcDNA3.1(+)、卡介苗(BCG)、pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT64、pcDNA/Ag85B+pcDNA/MPT64经肌肉注射法免疫小鼠,0、3、6周各1次,即PBS 组、pcDNA3.1组、BCG 组、pcDNA/Ag85B组、pcDNA/MPT64组及pcDNA/Ag85B+pcDNA/MPT64组. BCG组只在0周予皮内注射卡介苗1次.末次免疫后第5周用1×106CFU的H37Rv 经尾静脉实施攻击,攻击后6周处死部分小鼠,用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测血清总IgG、纯化蛋白衍生物(PPD)特异性脾淋巴细胞干扰素γ(IFN-γ)和白细胞介素4(IL-4)分泌水平,四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定特异性脾淋巴细胞增殖;作脾、肺组织荷菌量和病理学检查,并观察小鼠存活时间.结果 PBS组肺和脾器官荷菌量分别为lg-1(7.854±0.003)CFU/g和lg-1(7.190±0.016)CFU/g、pcDNA3.1组分别为lg-1(7.700±0.016)CFU/g和lg-1(7.072±0.068)CFU/g、BCG组分别为lg-1(6.449±0.002 )CFU/g和lg-1(5 .436±0.042)CFU/g、pcDNA/Ag85B组分别为lg-1(7.370±0.002 )CFU/g和lg-1(6.429 6±0.009)CFU/g、pcDNA/MPT64组分别为lg-1(7.547±0.003)CFU/g和lg-1(6.784±0.002)CFU/g、pcDNA/Ag85B+pcDNA/MPT64组分别为lg-1(6.918±0.002)CFU/g和lg-1(6.079±0.004)CFU/g,Ag85B与MPT64 DNA疫苗联合免疫组与DNA疫苗单独免疫组比较,差异有显著性(P<0.05),但不及BCG组(P<0.01);免疫小鼠诱导的特异性IgG、脾淋巴细胞增殖和IFN-γ的分泌以及肺、脾病理学改变和小鼠存活时间Ag85B与MPT64 DNA疫苗联合免疫组也明显优于其他DNA疫苗单独免疫组.结论 Ag85B与MPT64 DNA联合免疫在抗结核分枝杆菌感染过程中具有明显的免疫保护作用,但没有达到BCG的免疫保护水平.
-
结核分枝杆菌分泌蛋白64抗原模拟表位的筛选研究
MTB分泌蛋白64(MPT64)是MTB重要的保护性抗原,也是结核病血清学诊断的理想抗原之一[1].然而目前报道MPT64抗原对血清标本的直接检出率较低[2].20世纪80年代兴起的噬菌体展示随机肽库(phage display peptide library)技术是一种快捷、高效分析蛋白分子间相互作用的工具[3],尤其适于筛选生物活性大分子的配体.
-
结核分枝杆菌分泌蛋白64抗体适体的获得及血清学检测
指数级富集配体的系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELFEX)技术筛选的适体具有可体外合成、纯度高、稳定性强和易于保存等特点,并已用于检测多种靶物质.目前利用适体检测MTB分泌蛋白64(MFT64)及模拟胸腔积液中γ-干扰素含量已有报道~([1-2]),由于MPI64是结核病血清学诊断的重要抗原之一,本研究旨在利用SELEX技术筛选MPT64抗体高亲和性适体并用于血清学检测,对获得的适体进行初步功能学评价.
-
重组结核分枝杆菌黏附素、MPT64、38kD蛋白在结核性胸膜炎中的诊断价值比较
目的 探讨重组结核分枝杆菌黏附素(heparin-binding hemagglutinin adhesin,HBHA)、MPT64、38kD蛋白在结核性胸膜炎中的诊断价值.方法 选取结核性胸腔积液患者54例、恶性胸腔积液患者40为研究对象,以HBHA、MPT64、38kD蛋白为抗原,通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测患者胸腔积液中IgG抗体滴度.结果 结核性胸腔积液组3种抗原对应的IgG抗体吸光度均数分别为0.630,0.430,0.470;恶性胸腔积液组3种抗原对应抗体吸光度均数分别为0.340,0.248,0.271,结核组高于恶性胸腔积液组,差异有统计学意义(P＜ 0.001)；ROC曲线分析结果显示,胸水中HBHA抗体的诊断临界值定为0.46时用于鉴别诊断结核性胸膜炎和癌性胸水的敏感度为90.7％、特异度为90.0％、准确度为90.4％.诊断准确度高于MPT64及38kD蛋白.结论 HBHA蛋白抗体对于结核性胸膜炎与癌性胸水的鉴别诊断具有重要价值,优于MPT64及38kD蛋白.
-
Ag85B-MPT64融合基因疫苗对鼠结核分枝杆菌感染的保护作用
目的研究Ag85B-MPT64(AM)融合基因疫苗对鼠结核分枝杆菌感染的保护效果.方法 C57BL/6小鼠63只,随机分为磷酸盐缓冲液(PBS)、空质粒、卡介苗(BCG)、pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT64、pcDNA/Ag85B+pcDNA/MPT64、pcDNA/AM组,采用肌肉注射法免疫小鼠,0、3、6周各1次,BCG组只在0周予皮内注射卡介苗1次.末次免疫后第5周用H37Rv 经尾静脉注射实施攻击,攻击后6周处死部分小鼠,测血清总IgG,特异性脾淋巴细胞增殖、IFN-γ及IL-4分泌水平;观测脾、肺组织荷菌量和病理学检查以及剩余小鼠的存活时间.结果 AM基因疫苗组诱导的特异性的IgG、脾淋巴细胞增殖和IFN-γ的分泌以及肺、脾组织荷菌量、病理学改变和小鼠存活时间明显优于其他DNA疫苗单独免疫组.结论 AM DNA疫苗在抗结核分枝杆菌感染过程中具有明显的免疫保护作用.
-
结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64的克隆表达和纯化
目的 构建结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64原核表达载体并进行表达和纯化.方法 以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板扩增出MPT64基因,产物经纯化回收后与载体pMD-T连接转化,酶切鉴定,克隆到pET21a原核表达载体,测序鉴定插入序列完全正确者转化大肠杆菌BL21,诱导表达MPT64融合蛋白,利用亲和层析纯化表达产物,SDS-PAGE电泳进行鉴定.结果 成功构建MPT64表达载体,SDS-PAGE电泳鉴定成功表达MPT64蛋白.并以此蛋白进行结核抗体的检测,其特异性和敏感性分别为96%和43%.结论 成功表达结核分枝杆菌MPT64蛋白,并进行特异性和敏感性的检测,证明重组的MPT64蛋白有希望成为结核病血清学诊断的组合抗原的候选者之一.
-
结核分枝杆菌MPT64在毕赤酵母中的分泌表达
目的 克隆结核分枝杆菌MPT64基因全长,构建毕赤酵母分泌型表达载体,获得表达MPT64的重组毕赤酵母工程菌.方法 利用PCR技术扩增MPT64基因克隆到毕赤酵母分泌表达载体pPICZαA中;将正确的表达载体线性化后,电击导入到毕赤酵母GS115中,ZeocinTM抗性筛选正确的重组子;SDS-PAGE及Western-blot鉴定分泌表达MPT64的重组毕赤酵母.结果 克隆获得了正确的MFITM酵母分泌表达载体,并获得了相应的重组酵母株,该重组子经甲醇诱导培养后能分泌大小约30kDa的蛋白,该蛋白能特异地与His抗体结合.结论 本实验获得了酵母重组的结核杆菌MPT64蛋白,为探讨其生物学性能和临床上的应用奠定了实验摹础.
-
实时定量PCR检测耐异烟肼结核分枝杆菌Ag85B、38kDa及MPT64mRNA表达水平
目的 运用实时定量PCR(Real-time PCR)检测结核分枝杆菌耐异烟肼菌株和敏感株Ag85B、38kDa及MPT64编码基因(fbpB、psts1、mpt64)的mRNA表达水平,探讨结核分枝杆菌耐异烟肼株和敏感株的蛋白抗原在转录水平的差异性.方法 根据GenBank提供的序列,设计目的基因fbpB、psts1、mpt64及内参基因Siga的特异引物,将fbpB、psts1、mpt64及Siga扩增片段克隆入载体pMD18-T simple,重组质粒经纯化及倍比稀释,应用SYBR GreenⅠ荧光染料建立检测fbpB、psts1、mpt64的实时定量PCR方法,并应用此方法检测22株耐异烟肼菌株及25株敏感菌株(含H37Rv标准株)中fbpB、psts1、mpt64的mRNA表达水平.结果耐异烟肼菌株的fbpB表达水平为0.65±0.22,敏感菌株的表达水平为0.36±0.13,两者有显著性差异(t=5.683,P＜0.01).耐异烟肼菌株的psts表达水平为13.63±4.16,敏感菌株的表达水平为9.86±2.79,两者差异有统计学意义(t=3.869,P＜0.01).耐异烟肼菌株的mpt64表达水平为5.89±3.22,敏感菌株的表达水平为7.67±4.52,差异无统计学意义(t=1.552,P＞0.05).结论 成功建立了fbpB、psts1、mpt64基因的实时定量检测方法,检测显示耐异烟肼菌株的fbpB、psts1基因的mRNA表达水平显著高于敏感菌株,可能为耐异烟肼MTB的实验室诊断提供分子标识.
-
结核分枝杆菌MPT64抗原DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答
目的 研究结核分枝杆菌MPT64抗原DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答.方法 用表达MPT64的真核表达质粒pcDNA-M免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的特异性抗体滴度和抗体亚类.分离免疫小鼠的脾淋巴细胞,检测淋巴细胞增殖、IFN-γ和IL-12产生水平、流式细胞仪计CD+4细胞和CD+8细胞数、脾淋巴细胞特异性CTL杀伤效应.结果 MPT64基因免疫可诱导小鼠高水平的体液免疫应答,免疫小鼠脾淋巴增殖显著,IFN-γ和IL-12含量增加, CD+4细胞和CD+8细胞百分比明显增加,CTL杀伤效应明显.结论 MPT64 DNA疫苗可诱导小鼠有效的体液和细胞免疫应答,有可能作为新型TB疫苗的组分.
-
结核分枝杆菌mpt64基因重组穿梭表达载体的构建与鉴定
目的 在分枝杆菌系统中表达结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64.方法用PCR法扩增mpt64基因,构建表达载体穿梭质粒pDE22-mpt64.在母牛分枝杆菌中表达MPT64蛋白,间接免疫荧光和Western-blot鉴定、离子亲和层析法纯化目的蛋白.结果大肠-分枝杆菌穿梭质粒pDE22-mpt64可以在母牛分枝杆菌中复制并表达26kDa蛋白.蛋白印迹实验证实可与抗His单克隆抗体特异结合.结论成功构建了结核分枝杆菌mpt64基因重组穿梭表达质粒,为进一步研究该蛋白奠定了的基础.
-
结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达
目的构建结核分枝杆菌早期分泌蛋白Ag85B和MPT64融合基因(AM)及其原核表达质粒并进行表达.方法采用gene SOEing法将 ag85b和mpt64用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser)3融合,经限制性内切酶切后克隆入原核表达载体pET32a中,进行酶切、PCR鉴定和DNA序列测定.将重组质粒转染Ecoli.BL21,经过IPTG诱导后其表达产物进行SDS-PAGE和免疫印迹分析.结果 AM融合基因定向克隆入pET32a中,双向测序验证碱基突变率为0.11%(2/1707),均为无意义突变.SDS-PAGE和免疫印迹分析结果均显示在约73kDa的位置可见明显的蛋白条带.结论成功地构建了ag85b-mpt64融合基因及其原核表达质粒,重组质粒能够在大肠杆菌在中表达.
-
应用MPT64检测建立结核分枝杆菌药敏新方法的初步探索
目的 初步探索应用MPT64检测建立一种结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)药敏新方法的可行性,确定药敏方法的实验条件和实验程序.方法通过检测MTB标准株和临床株的MPT64分泌,验证MPT64检测用于药敏结果指示的有效性；对不同方式制备的菌悬液进行MPT64检测,确定药敏方法的接种程序.结果指示有效性试验中,MTB标准株和60株MTB临床株的菌悬液MPT64检测均阳性;药敏接种程序确定试验中,直接挑取菌落方式配制的各种浓度MTB菌悬液(分别为1、0.1、0.01和0.001 mg/ml)MPT64检测均阳性,而生理盐水洗涤方式配制的各种浓度MTB菌悬液(分别为1、0.1、0.01和0.001 mg/ml)M PT64检测均阴性.结论MPT64检测能有效指示MTB的生长；洗涤方式制备菌悬液可避免MTB原代菌株产生的MPT64被带入培养基中,从而能够更真实地反映无药和含药培养基中MTB的生长情况.
-
结核分支杆菌ESAT6-MPT64融合蛋白的构建及应用性初步研究
目的:构建表达结核分支杆菌ESAT6和MPT64融合蛋白,并评价其在血清学诊断中的价值.方法:PCR法扩增esat6和mpt64基因,构建原核表达载体pProEX HTb-EM,表达、纯化ESAT6-MPT64融合蛋白,Western-blot 分析其抗原性.用该重组蛋白ELISA法检测结核病患者血清.结果:原核表达的ESAT6-MPT64融合蛋白约40 000,Western-blot证实重组蛋白与ESAT6和MPT64多克隆抗体特异结合.重组蛋白用于检测结核病患者血清,敏感性为67.7%,特异性为82%.结论:重组的ESAT6-MFT64融合蛋白有可能用于结核病免疫诊断试剂的制备.
-
中国结核分枝杆菌MPT64蛋白多态性及对MPT64抗原检测试剂盒的敏感性影响
目的 探讨中国结核分枝杆菌MPT64抗原的多态性及对其T/B细胞抗原表位的影响;应用MPT64抗原检测试剂盒对MPT64基因突变菌株和野生菌株进行检测,以进一步分析MPT64抗原多态性对结核感染检测的影响. 方法 从中国疾病预防控制中心传染病预防控制所结核室保存的2 346株国内结核分枝杆菌复合群临床分离株中挑选180株,对其MPT64基因扩增后进行序列比对,比较其T/B细胞抗原表位与非表位的多态性,对突变的菌株与野生菌株进行BACTEC MGIT 960系统与液体培养管进行培养,报阳后,用胶体金标记抗MPT64单克隆抗体采用免疫层析色谱法进行MPT64蛋白检测. 结果 180株临床分离株中有15株(包括2株BCG菌株)表现有MPT64蛋白的多态性,占菌株数的8.33％,8株菌有63 bp的缺失,4株菌有单位点的非同义突变,1株是单位点插入.MPT64基因的突变造成13个T细胞抗原表位(56.52％)和4个B细胞抗原表位(占80％)的改变,T/B细胞抗原表位区的dN/dS值均高于对应的非表位区.8株有63 bp缺失的菌株胶体金检测阴性,对应的野生株检测阳性;5株单位点突变的菌株与对应的野生菌株胶体金检测均阳性. 结论 中国结核分枝杆菌MPT64蛋白存在多态性,这是产生抗原改变的原因之一,这会影响抗原相关功能的改变并引起免疫逃逸.63 bp缺失会造成MPT64抗原检测试剂盒的假阴性,而某些单位点突变对检测效率无影响.
-
重组结核分枝杆菌 MPT64的克隆与表达
目的：克隆和表达结核分枝杆菌抗原 MPT64，并分析其免疫活性。方法：以结核分枝杆菌 H37Rv 基因组 DNA 为模板，PCR 扩增 mpt64基因，克隆至 T 载体 pMD18-T，转化入 E.coli DH5α，菌落 PCR 鉴定阳性克隆并测序分析。将测序正确的 pMD18-T-mpt64的 mpt64基因亚克隆至表达载体 pET-28a，构建重组质粒 pET-28a-mpt64，转化 E.coli BL21中，PCR 和双酶切鉴定阳性重组子，IPTG 诱导 MPT64表达，亲和层析纯化，western-blot 分析其免疫活性。结果：成功构建 pET28a-mpt64重组表达质粒，表达、纯化获得分子量约为26kDa 的 MPT64，并能被结核病人血清识别。结论：克隆表达获得具有免疫活性的重组结核分枝杆菌 MPT64蛋白。
-
重组结核病疫苗rBCG-IL-12p70-MPT64免疫原性研究
目的 构建可表达人细胞因子IL-12p70及结核分枝杆菌免疫显性抗原MPT64融合蛋白重组卡介苗,研究其免疫效应,为获取较卡介苗(BCG)更具保护作用的结核病新疫苗奠定基础.方法 采用基因重组技术构建重组卡介苗rBCG-IL-12p70-MPT64(rBCG-IM),将其免疫BALB/c小鼠,分别于免疫后15、30、60及90 d,iELISA检测特异性抗体滴度水平,评价疫苗诱导的体液免疫.XTT检测受特异性抗原刺激后脾淋巴细胞增殖反应,流式细胞术观察CD4+T、CD8+T细胞比例变化,细胞因子检测试剂盒检测IFN-γ的诱生量,评价疫苗诱导的细胞免疫.结果 与BCG相比,重组疫苗rBCG-IM可诱导更强的脾细胞增殖反应、更高的IFN-γ诱生量,以及更高比例的CD4+T、CD8+T细胞.同时,rBCG-IM可诱导产生较BCG更高水平的IgG、IgG1和IgG2a抗体滴度,IgG2a/IgG1比值变化趋势提示该疫苗可诱导Th1型免疫应答.结论 重组卡介苗rBCG-IM可诱导产生较BCG更强、持续时间更长的细胞免疫及体液免疫反应,具有较强的深入研究价值.
-
结核分支杆菌MPT64基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达、纯化和诊断运用
目的利用大肠杆菌表达系统大量获得重组MPT64蛋白,分析其生物学、免疫学特性,并初步评估其在结核病血清学诊断方面的价值.方法用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分支杆菌H37Rv中获得了MPT64基因,并构建大肠杆菌表达株;聚丙烯酰胺凝胶电泳重组蛋白;Western印迹及酶联免疫吸附测定法(ELISA)分析重组蛋白免疫原性,并检测血清的抗结核抗体.结果构建了能表达重组MPT64的大肠杆菌工程菌,表达的重组蛋白蛋白为可溶性形式,表达量占细胞总蛋白的30%,分子量约23kD.经离子交换柱纯化后,重组蛋白纯度达90%以上.Western印迹结果证实该重组蛋白能与抗结核分支杆菌多克隆抗体发生特异免疫结合反应.ELISA分析表明该纯化的重组抗原能区别抗结核抗体阳性患者血清及正常人血清.结论该实验获得了能高效表达MPT64蛋白抗原的大肠杆菌工程菌.纯化的该重组蛋白具有特异的免疫原性,有一定的诊断运用价值.
-
结核分枝杆菌候选抗原基因克隆与表达质粒构建
目的克隆并构建编码结核分枝杆菌(MTB)ESAT6,Ag85B和MPT64分泌蛋白的重组表达质粒.方法采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中分别扩增出ESAT6,Ag85B和MPT64基因(288bp,978bp and 687bp),并克隆到T载体,然后用双内切酶消化后,与同样酶消化的pGEX-4T-2连接,转化大肠杆菌E.coli DH5α,阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定.结果酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符,测序结果与文献报道一致,证实符合表达框架.结论成功地克隆并构建了ESAT6,Ag85B和MPT64基因的重组表达质粒pGEX-ESAT6,pGEX-Ag85B和pGEX-MPT64.
-
应用MPT64分泌为结核杆菌生长指示的适宜检测时点研究
目的:探讨应用免疫胶体金法检测结核分枝杆菌复合群特异分泌蛋白MPT64指示结核杆菌生长的适宜检测时间,为创建新型、实用的结核杆菌分离培养方法提供科学依据.方法:在第7、14、21、28、35、42天(即1～6周末)对BACTEC MGIT 960分枝杆菌快速培养样本实验瓶进行MPT64检测,以出现阳性检测结果或第42天为检测终点,以BACTEC MGIT 960分枝杆菌快速培养及菌种鉴定结果为参照标准分析适宜的检测时间.结果:在1 265例临床样本分枝杆菌分离培养中,依据后续分枝杆菌菌种鉴定结果,应用BACTEC MGIT 960分枝杆菌快速培养法,178例样本分离到结核杆菌,其中168例MPT64检测阳性:168例MPT64检测阳性样本中,在第1、2、3、4、5、6周呈现MPT64检测阳性的样本数分别为29、75、47、9、6和2例,其阳性检出率分别占MPT64检测阳性的17.26%、61.90%、89.88%、95.23%、98.81%和100%.结论:应用免疫胶体金法检测结核分枝杆菌复合群特异分泌蛋白MPT64指示结核杆菌生长,在2、4周末可分别检测到60%与95%以上的MPT64阳性样本,可以分别视为快速检测和培养终点检测的适宜时点,但更望能有连续监测方法的问世.
-
MPT64检测作为结核分枝杆菌生长指标的研究
目的 分析把检测MPT64作为结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)生长指标的可行性.方法 对MTB阳性液体培养物进行MPT64检测,分析其作为MTB生长指标的有效性；对不同稀释浓度(1mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml和0.001mg/ml)的MTB阳性液体培养物进行MPT64检测,分析该项检测的指示低限；对不同放置时间(10d、30d、60d)的MTB阳性液体培养物进行MPT64检测,分析指示的稳定性.结果 20份MTB阳性液体培养物的MPT64检测均阳性,该项检测能100％有效指示MTB的生长；3份MTB阳性液体培养物1mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml稀释浓度的MPT64检测均阳性,其中2份MTB阳性液体培养物0.001 mg/ml稀释浓度的MPT64检测阳性,而另1份则检测阴性,该项检测的指示低限为0.01mg/ml；10份MTB阳性液体培养物放置30d、60d后MPT64检测均为阳性,该项检测用于指示MTB生长具有很好的稳定性.结论 MPT64检测可作为MTB生长的一种指示手段.
