基因重组卡介苗在疾病预防和治疗中的应用

分枝杆菌Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin (BCG、卡介苗)是应用了近80年的预防结核的减毒活疫苗,自1948年以来世界上已有35亿人接种.近年来又被证明具有治疗性疫苗的价值.疫苗是防治病原微生物感染的简便而有效的手段,以细菌和病毒为载体的活疫苗是疫苗研究的重要领域.

重组结核病疫苗rBCG-IL-12p70-TB10.4的免疫效应

目的 将成功构建的重组卡介苗rBCG-IL-12p70-TB10.4免疫BALB/c小鼠,研究其免疫效应,为结核病新疫苗的研发提供依据.方法 将融合基因IL-12p70-TB10.4克隆入pMV361构建重组质粒,以电转化方式将重组质粒导入卡介苗基因组,构建重组结核病疫苗rBCG-12p70-TB10.4 (rBCG-IT).将此重组卡介苗免疫BALB/c小鼠,分别于免疫后3、6、9和12周,用间接ELISA检测特异性抗体滴度水平,XTT检测脾细胞增值反应,流式细胞仪检测脾CD4+T、CD8+T细胞亚型的比例,ELISA试剂盒检测细胞因子的诱生.结果 在免疫后3～12周,rBCG-IT组脾细胞增殖反应均明显强于其他各组(P＜0.01),该组IFN-γ诱生量及CD4+T细胞比例均显著高于rBCG-I组、rBCG-T组及BCG组(P＜0.01).IgG2a/IgG1比值在免疫后各时间点的变化趋势提示rBCG-IT可诱导Th1型细胞免疫应答.结论 重组疫苗rBCG-IT可诱导产生较BCG更强、持续时间更长的特异性细胞免疫应答,可对其免疫保护作用进行深入研究.

分泌融合蛋白Ag85B-ESAT-6重组卡介苗在小鼠体内的免疫效应

目的 研究分泌融合蛋白Ag85B-ESAT-6重组卡介苗(rBCG)在小鼠体内诱导的免疫效应.方法 以2×106 CFU的rBCG或BCG皮下接种BALB/c小鼠,免疫后第4、6、8周时用ELISA测定TB-PPD特异的血清抗体滴度;分离脾淋巴细胞,以流式细胞术测定CD4+和CD8+ T细胞亚群百分比;TB-PPD刺激后以MTT法测定淋巴细胞增殖程度,ELISA检测诱生IFN-γ和IL-10水平.结果 rBCG和BCG免疫组小鼠血清特异性抗体滴度分别达1∶5 120和1∶2 560,差异有统计学意义(q=3.89,P=0.034).rBCG组的IFN-γ水平在第8周达高(597.1 pg/ml),同期BCG组为416.7 pg/ml,差异有统计学意义(q=10.60,P<0.01).rBCG组IL-10水平第4周和第6周时也高于BCG组(P<0.05),第8周回落.除第6周外,rBCG组的淋巴细胞增殖指数都高于BCG组(P<0.05).第8周rBCG组和BCG组CD4+T亚群分别占(71.1±2.6)%和(62.3±2.0)%,差异有统计学意义(q=4.16,P=0.026);CD8+T亚群分别占(35.9±1.7)%和(26.9±2.8)%,差异有统计学意义(q=4.52,P=0.019).结论 融合蛋白Ag85B-ESAT-6引入BCG增强了其抗MTB反应.

重组卡介苗对EB病毒阳性肿瘤的抑制作用研究

目的 研究重组卡介苗(Recombinant BCG, rBCG)对EB病毒阳性肿瘤的抑制作用.方法 建立EB病毒阳性肿瘤(GT39)荷瘤小鼠(C57BL/6)模型,对小鼠存活情况、肿瘤重量、成瘤时间进行分析,流式细胞仪测定CD4+T细胞增殖情况,HE染色法对小鼠肿瘤组织中淋巴细胞浸润情况进行分析;检测rBCG对肿瘤的抑制作用;使用统计学软件SPSS 11.0进行单因素方差分析(One-way ANOVA),对rBCG抑制效果进行分析和评价.结果 与对照组相比,rBCG组肿瘤生长明显缓慢,成瘤时间延迟,小鼠生存期明显延长.结论 rBCG在小鼠体内对EB病毒阳性肿瘤细胞具有抑制作用.

表达抗原 Rv3478的重组卡介苗的实验研究

目的：本研究选取结核杆菌优秀抗原Rv3478，构建重组疫苗rBCG：Rv3478并对其进行免疫原性评价。方法 PCR扩增基因Rv3478，构建重组质粒Rv3478-pMV261之后电转进入BCG感受态细胞中，另外将扩增的基因片段导入pET-28a中，构建表达载体Rv3478-pET-28a（ BL21）表达蛋白Rv3478，蛋白免疫小鼠获取多克隆抗体，蛋白印迹方法筛选得到表达Rv3478的重组卡介苗；用构建好的重组卡介苗刺激巨噬细胞，收集细胞培养上清 ELISA 检测细胞因子的分泌；重组疫苗rBCG：Rv3478（R3）免疫小鼠，PBS、BCG、BCG：pMV261（R0）作对照组。分别在免疫4周和12周后处死小鼠，用ELISPOT、ELISA、流式细胞术等方法检测疫苗细胞免疫和体液免疫水平。结果成功表达蛋白Rv3478，免疫小鼠后获得多克隆抗体；成功构建重组疫苗R3；免疫小鼠后，能够引发强烈的细胞免疫应答（强烈的IFN-γ反应，高水平的TNF-α的分泌），促进外周血CD4＋／CD8＋T细胞比例增加， CD44＋CD62L＋T细胞百分比增加。结论构建的重组疫苗R3能够引发强烈的免疫应答，显示出良好的免疫原性，具有良好的抗结核潜力，值得进一步研究。

血吸虫重组卡介苗--Sj26GST疫苗的有关毒性研究

由于BCG免疫效果不够理想,以及结核分枝杆菌耐药性的产生,促使人们开始研制新的结核病疫苗.利用BCG独特的安全性和免疫佐剂作用和日本血吸虫中相对分子量为26×103的谷光甘肽S转移酶(Sj26GST)的良好免疫原性,已经构建出了一种重组卡介苗--Sj26GST(rBG-Sj26GST).我们就这种疫苗对小鼠的毒性进行了研究,从而为疫苗的安全性提供实验依据.

esat6-重组卡介苗对结核病预防作用的研究

目的 评价esat6-重组卡介苗对结核病预防效果.方法 观察esat6-重组卡介苗对结核分枝杆菌感染的预防试验中实验动物半数死亡时间、一定时间内的死亡率、大体病变、T细胞及B细胞免疫功能等指标,评价esat6-重组卡介苗对结核分枝杆菌感染的预防效果.结果 用esat6-重组卡介苗对结核分枝杆菌感染进行预防,esat6-重组卡介苗及卡介苗与生理盐水对照组比都能延长结核分枝杆菌感染小鼠的半数死亡时间,降低2个月内的死亡率.其中esat6-重组卡介苗组效果显著,与卡介苗组比有显著差异.结核分枝杆菌攻击后2个月,处死小鼠时,esat6-重组卡介苗免疫组小鼠脏器大体病变较轻,其他各组之间无显著差别(各组小鼠脏器研磨、消化后稀释为不同梯度进行培养,esat6-重组卡介苗免疫小鼠肺结核分枝杆菌生长的低稀释度主要集中在10-5,肝、脾结核分枝杆菌生长的低稀释度主要集中在10-4.抗体检测结果及淋巴细胞增殖实验各组间无显著差别).结论 初步实验表明,esat6-重组卡介苗能提高卡介苗对结核分枝杆菌感染的预防作用.

表达Ag85B-ESAT6的重组卡介苗在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力

超表达分泌蛋白Ag85B的重组卡介苗免疫豚鼠获得的保护效力超过卡介苗[1],这为研究新型结核病疫苗提供了思路.为了全面评估我们构建的融合表达Ag85B与ESAT6的重组卡介苗免疫学特性,我们进一步研究了该菌株在小鼠体内诱发的免疫应答水平及其对结核分枝杆菌毒株感染的保护力.

结核分枝杆菌分泌蛋白64基因重组腺病毒疫苗的构建

卡介苗是当前惟一能够应用于人体的结核病疫苗,但对成人肺结核的保护效率很低.DNA、多肽及病毒等亚单位疫苗能够加强卡介苗或重组卡介苗的免疫保护效果,目前被认为是结核病疫苗研究的重要方向之一~([1-2]).同DNA疫苗和多肽疫苗相比,重组活的结核病亚单位疫苗能在体内持续表达MTB特异性抗原,使其具有高效和经济的优势.

重组人干扰素α-2b-卡介苗对膀胱癌MB49细胞的体外作用

目的 探讨重组人干扰素α-2b-卡介苗(hIFN-α-2b-BCG)对膀胱肿瘤细胞的直接效应及其作用机制.方法 采用体外实验,将重组hIFN-α-2b-BCG直接作用于小鼠膀胱癌MB-49细胞,荧光染色后,在光镜和电镜下观察细胞的变化.采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)和流式细胞仪(FCM),检测野生型BCG和重组hIFN-α-2b-BCG对MIM9细胞的影响.结果 重组hIFN-α-2b-BCG与MB49细胞共培养后,光镜下见肿瘤细胞变圆,增殖速度明显减缓,部分细胞脱壁,胞浆呈大量空泡和颗粒状.透射电子显微镜下可见肿瘤细胞表面微绒毛脱落,细胞质坏死,大量空泡,细胞表面有出泡现象.吖啶橙染色后,在荧光显微镜下可见肿瘤细胞聚集成团状的细胞球体,胞突消失,凋亡小体出现.Hoechst33258染色后,可见大量肿瘤细胞呈明亮的蓝色荧光.MTT测定结果显示,随共培养时间延长,重组hIFN-α-2b-BCG可不同程度抑制肿瘤细胞的生长,抑制率高于野生BCG.FCM检测结果显示,24 h后野生型BCG诱导凋亡率为10.8%,重组hIFN-α-2b-BCG诱导凋亡率为19.7%;48 h后野生型BCG诱导凋亡率为20.9%,重组hIFN-α-2b-BCG诱导凋亡率为46.6%.两者比较,差异有统计学意义(P＜0.01).重组hIFN-α-2b-BCG上调MB49细胞MHC-Ⅰ表达,具有时间依赖性,且上调比例明显高于野生型BCG(P＜0.01).结论 重组hIFN-α-2b-BCG成功诱导肿瘤细胞凋亡,有更高的调节免疫原性、抗肿瘤作用和细胞毒性.

重组骨保护素-卡介苗的构建及防治骨质疏松症的研究进展

人骨保护素(osteoprotegerin.OPG)为一种破骨细胞抑制因子,其对破骨细胞的形成、分化和调节骨吸收的具有重要作用,骨保护素的研究在骨质疏松、骨硬化病、类风湿性关节炎、骨肿瘤、心血管疾病等临床疾病的发病机制及治疗方面均取得了较大进展.目前国外已经进行重组骨保护素治疗绝经后骨质疏松的临床试验,未发现明显毒性作用.本文对重组骨保护素-卡介苗的构建及防治骨质疏松症的研究进展发展前景进行了展望.

人颗粒溶素活性肽和小鼠单链白细胞介素-12重组卡介苗的构建及鉴定

目的 构建含人颗粒溶素(GLS)活性肽和小鼠单链白细胞介素-12(mIL-12)基因的重组卡介苗(BCG),并鉴定其向真核细胞递呈质粒的能力.方法 以分子生物学方法构建含相对分子质量为9 000的颗粒溶素活性肽基因和小鼠IL-12基因及分枝杆菌复制子OriM的真核穿梭共表达质粒pBM9,以电转化的方式将pBM9质粒转入BCG,构建重组BCG,抽提质粒进行PCR鉴定;将重组菌感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,经RT-PCR检测重组菌向真核细胞递呈质粒的能力.结果 重组BCG可扩增出与GKS基因和mIL-12基因相符的目的条带.重组BCG感染RAW264.7细胞96 h后,经RT-PCR可扩增出267 bp的GLS基因条带和1 632 bp的mIL-12基因条带.结论 已成功构建含GLS和mlL-12基因的重组BCG,该重组BCG能向小鼠巨噬细胞递呈携带的目的基因.

猪弓形虫重组卡介苗的构建及其免疫保护性

目的 构建弓形虫Rhomboid基因和猪IL-2基因的重组卡介苗(BCG),并分析其免疫保护效果.方法 应用RT-PCR技术分别扩增弓形虫Rhomboid基因和猪IL-2基因,克隆至pMD 18-T载体中,双酶切鉴定及测序正确后,将弓形虫Rhomboid基因和猪IL-2基因串联后分别连接至穿梭表达载体pMV261和整合表达载体pMV361中,电转化BCG,制备重组BCG pMV261-IL-2-Rho和pMV361-IL-2-Rho.分别经颈部肌肉注射免疫猪,共3次,每次间隔2周,免疫剂量均为108 CFU/只,采用ELISA法检测免疫前后猪体内抗体(IgG)滴度、Th1型及Th2型细胞因子的变化情况;第3次免疫后2周通过腹腔注射的方式接种弓形虫China I株速殖子1×108个/只进行攻虫试验,观察重组BCG对猪的免疫保护效果.结果 成功构建了重组BCG pMV261-IL-2-Rho和pMV361-IL-2-Rho.重组BCG免疫猪后,随着免疫次数的增加,血清中抗体滴度也逐渐升高,且与PBS对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.01).3次免疫后,pMV261-IL-2-Rho组血清Th1型细胞因子IL-2、IFNγ和IL-12的表达水平均明显提高,与PBS对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05),而pMV361-IL-2-Rho组血清IL-2、IFNγ和IL-12的水平虽略有升高,但与PBS对照组相比,差异无统计学意义(P＞0.05);各组在免疫过程中Th2型细胞因子IL-4水平均未发生明显变化.攻虫后各组猪出现精神沉郁,食欲下降,体温升高等症状,耐过发病期后的猪,食欲逐渐恢复,体温渐趋正常,各种症状减轻,且各组猪在攻虫后20 d均无死亡.结论 构建的基因重组BCG pMV261-IL-2-Rho对猪弓形虫感染具有一定的免疫保护作用.

结核活疫苗的研究进展

近年研究较多的结核活疫苗主要有重组卡介苗、减毒牛分枝杆菌和减毒结核分枝杆菌,另外对田鼠分枝杆菌和猿分枝杆菌也有所研究.大多数结核活疫苗在动物模型中的免疫效果低于或相当于卡介苗,只有极少数的免疫效果优于卡介苗.

重组卡介苗的研究进展

卡介苗具有使用广泛、安全、价格低、稳定性好等优点,本文就重组卡介苗在免疫预防、肿瘤的基因治疗和其他研究方面的应用作一综述.

全球结核病疫苗研究进展

本文旨在对全球结核病疫苗研究进展进行系统综述,描述国际上目前进入临床试验不同阶段的新型疫苗,包括重组卡介苗、亚单位疫苗、治疗性疫苗等,分析我国结核病疫苗研究现状,介绍国际研究发展趋势,如人类疫苗计划、全细胞疫苗、多阶段疫苗等,并对存在的问题和挑战进行讨论,展望未来发展趋势.

036 产生霍乱毒素B亚单位的重组卡介苗诱导的免疫应答

细粒棘球绦虫重组BCG-EgG1Y162菌株的构建和表达

目的 构建和表达细粒棘球绦虫重组卡介苗(BCG)菌株rBCG-EgG1Y162.方法 通过基因工程技术将细粒棘球绦虫抗原EgG1Y162的编码基因与大肠埃希菌(E.coli)-分枝杆菌穿梭表达质粒载体pMV361重组,并转化E.coli后进行扩增.重组质粒pMV-EgG1Y162经PCR和双酶切鉴定后,进行测序.将鉴定正确的rpMV-EgG1Y162通过电穿孔技术转化至感受态BCG菌株中,构建rBCG-EgG1Y162.经PCR和双酶切鉴定正确后,扩增培养2周,并于45℃放置30 min,诱导目的蛋白表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白表达情况,并以兔抗原核表达重组蛋白EgG1Y162血清为一抗进行蛋白质印迹(Western blotting)分析.结果 重组质粒rpMV-EgG1Y162经PCR扩增和双酶切后,均获得约360 bp的EgG1Y162目的基因片段,与预期片段长度一致,测序结果表明插入序列正确.将其通过电穿孔转化BCG菌株后,rBCG-EgG1Y162生长良好,经酶切和PCR鉴定正确.SDS-PAGE和Western blotting结果显示,目的表达产物的相对分子质量(Mr)约为71 000.结论 构建和表达了细粒棘球绦虫rBCG-EgG1Y162菌株.

微小隐孢子虫重组BCG-Cp23疫苗的构建及鉴定

目的 构建和鉴定微小隐孢子虫Cp23基因卡介苗重组疫苗. 方法 用微小隐孢子虫感染免疫抑制BALB/c小鼠,用蔗糖密度梯度离心法纯化其粪便中的卵囊,酚-氯仿法提取微小隐孢子虫的基因组DNA,PCR扩增Cp23基因片段,然后将其克隆TA载体;通过酶切、测序鉴定后,将Cp23基因片段用限制性内切酶切下克隆至大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV262结核杆菌热休克蛋白(HSP)启动子下游,构建重组质粒pMV262-Cp-23,用电穿孔将该质粒导入野生卡介苗(BCG-WT)构建微小隐孢子虫Cp23基因卡介苗重组疫苗.结果 扩增出约360bp的微小隐孢子虫Cp23基因片段并成功构建pMV262-Cp23质粒,通过PCR扩增和提取质粒、酶切表明质粒正确导入BCG-WT中.结论 成功构建微小隐孢子虫Cp23基因卡介苗重组疫苗.

GLS/IL-12重组BCG的构建及其对小鼠结核病疗效的研究

目的 构建携带编码人天然颗粒溶素(GLS)和小鼠IL-12基因质粒(pZM03)的重组卡介苗(BCG),并观察其对结核分枝杆菌感染的疗效与机制.方法 将分枝杆菌复制子OriM克隆进已含GLS和IL-12的多启动子真核共表达载体pBudCE4.1中(pZM02),得到穿梭质粒pZM03,以pZM03电转化BCG获得重组BCG.结核分枝杆菌H37Rv感染Balb/c小鼠4周后分别用生理盐水、BCG、pZM03和重组BCG治疗,于第一次治疗后3个月,处死小鼠,检测器官荷菌量、脾淋巴细胞IFN-γ和TNF-α的分泌水平、血清IL-12和肺、脾组织中GLS表达,同时观察小鼠肺、脾组织病理改变情况.结果 重组BCG治疗组肺、脾组织荷菌量比生理盐水组、BCG组和质粒组显著降低.重组BCG组和pZM03组经PPD刺激后IFN-γ和TNF-α分泌水平明显高于BCG组和生理盐水组.重组BCG组血清IL-12水平明显高于生理盐水组,但与pZM03质粒组和BCG载体组无明显差异.用免疫组化检测到小鼠肺及脾组织中GLS的表达.生理盐水和BCG组肺组织病理改变以渗出为主,病变广泛,增生改变不明显;重组BCG病变范围局限,并有大量类上皮细胞、泡沫细胞等细胞出现.结论 成功构建携带GLS和IL-12的重组BCG;重组BCG对小鼠结核病有一定免疫治疗作用,系增强宿主Th1型免疫应答和抗菌活性有关.