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H3亚型流感重组腺病毒候选疫苗的构建及鉴定
目的 研制一种制备工艺简单、无需鸡胚即可大量生产的预防季节性H3亚型流感重组腺病毒候选疫苗.方法 构建含有外源H3HA基因的重组腺病毒穿梭载体质粒pacAd5 H3HA,并用酶切的方法进行鉴定;将鉴定阳性的pacAd5-H3HA与腺病毒骨架载体质粒线性化后用脂质体介导共转染HEK293细胞,分别采用RT-PCR、间接免疫荧光试验以及Western blot方法对构建的H3亚型流感重组腺病毒疫苗进行鉴定. 结果 RT-PCR扩增出约1.8 kb片段,与目的片段大小相同,表明外源基因H3HA成功插入重组腺病毒.间接免疫荧光试验显示重组腺病毒转染后的HEK293细胞中检测到特异性蛋白,Western blot显示在70 ku处有一反应条带,表明该H3HA蛋白能被兔抗H3亚型HA蛋白血清识别. 结论 构建的H3亚型流感重组腺病毒能在HEK293细胞中表达具有反应原性的H3HA蛋白,为后续的动物实验奠定了基础.
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H3亚型流感重组腺病毒的纯化工艺研究
目的 为了探索经济、高效的腺病毒的纯化工艺,采用阴离子交换层析和分子筛层析两步法对H3亚型流感重组腺病毒pacAd-H3-EHA-H1HA1 new进行纯化,并评价纯化效果. 方法 利用7L生物反应器培养HEK-293细胞,用于对H3型流感重组腺病毒进行扩增;利用冻融的方法使病毒从细胞中释放,通过阴离子交换层析和分子筛层析法纯化病毒,用分光光度计检测纯化样品的纯度,并测定病毒的滴度和回收率. 结果 纯化后的样品经PCR鉴定正确,纯化前后的病毒滴度分别为5.6×109 TCID50/ml和1.1×1010 TCID50/ml,纯化后样品纯度(A260/A280值)分别为2.01和1.26,阴离子交换层析纯化的回收率为31.5％,分子筛层析纯化的回收率为81.4％,总回收率为25.6％. 结论 利用阴离子交换层析和分子筛层析两步法纯化H3亚型流感重组腺病毒的回收率和滴度高,该方法可用于重组腺病毒的纯化.
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欧洲型PRRSV重组腺病毒疫苗猪免疫试验效果评价
目的 评价欧洲型PRRSV重组腺病毒疫苗pacAd-EU-ORF3-ORF5-IL18猪体免疫效果. 方法 用鉴定正确的重组腺病毒进行猪免疫试验,通过淋巴细胞亚群检测、细胞因子检测和免疫组化检测分析其免疫效果. 结果 猪淋巴细胞亚群检测显示重组腺病毒pacAd-EU-ORF3-ORF5-IL18刺激CD4+和CD8+表达量在21 d、35 d、49 d分别为PBS组的1.53、1.84、1.90倍和1.41、1.76、1.53倍,差异有统计学意义(P＜0.05);ELISA检测pacAd-EU-ORF3-ORF5-IL18免疫猪血清IL-4和IFN-γ水平在14d时的表达量分别是PBS组的1.45和1.46倍(P＜0.05),而在35d时分别是PBS组的1.81和1.79倍(P＜0.05).免疫组化检测免疫猪肺、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴组织病毒量相对于野毒组和PBS组显著减少. 结论 重组腺病毒pacAd-EU-ORF3-ORF5-IL18疫苗,具有良好的免疫原性,能提高猪细胞免疫和体液免疫水平.
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结核分枝杆菌分泌蛋白64基因重组腺病毒疫苗的构建
卡介苗是当前惟一能够应用于人体的结核病疫苗,但对成人肺结核的保护效率很低.DNA、多肽及病毒等亚单位疫苗能够加强卡介苗或重组卡介苗的免疫保护效果,目前被认为是结核病疫苗研究的重要方向之一~([1-2]).同DNA疫苗和多肽疫苗相比,重组活的结核病亚单位疫苗能在体内持续表达MTB特异性抗原,使其具有高效和经济的优势.
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携带丙型肝炎病毒非结构蛋白3基因的重组腺病毒构建研究
目的构建表达丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3 (NS3)的复制缺陷型重组腺病毒,为防治HCV感染的基因免疫和基因治疗提供实验基础. 方法将HCV NS3基因定向克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,经与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠埃希菌BJ5183内同源重组后,转染293细胞进行包装,并反复感染293细胞进行扩增. 结果通过PCR扩增、酶切、核酸测序及Western杂交法检测鉴定,均证实插入穿梭质粒中的片段为HCV NS3基因(基因型1b);所包装出的复制缺陷型重组腺病毒AdEasy-GFP-NS3具有良好的感染能力,并可在293细胞中表达HCV NS3蛋白. 结论 AdEasy-GFP-NS3携带有HCV NS3基因,能有效地感染293细胞并高效表达,从而为丙型肝炎基因疫苗的进一步研究奠定了基础.
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CVB3VP1蛋白和重组腺病毒单独及联合应用的免疫效果
[目的]观察柯萨奇病毒B3(coxsackievirus group B type 3,CVB3)VP1蛋白和重组腺病毒Ad/vp1单独及联合应用的免疫效果.[方法]大量扩增重组腺病毒Ad/vp1,制备并纯化CVB3/VP1蛋白,肌肉注射免疫BALB/c小鼠.小鼠随机分为4组:腺病毒组:肌肉注射Ad/vp1,共2次;蛋白组:注射VP1蛋白,共3次;腺病毒/蛋白组:第1次注射Ad/vp1,第2、3次注射VP1蛋白;PBS对照组.各次注射间隔时间为3周.腺病毒每次接种4x107 pfu/只,VP1蛋白每次接种100μg/只.用中和试验法和ELISA法分别检测每次免疫后血清中和抗体和IgG抗体滴度;CCK-8法检测淋巴细胞增殖活性和CTL杀伤活性;用致死量病毒感染后检测血中病毒滴度,并观察小鼠的生存情况.[结果]中和抗体滴度及血清特异性IgG抗体水平随免疫次数增加而提高,末次免疫后,蛋白组(71.26±1.31,33 779.40±1.46)、腺病毒/蛋白组的(56.56±1.44,22 286.09±1.36)中和抗体及IgG抗体滴度明显高于腺病毒组(16.82±1.37,800±1.63) (P<0.05);蛋白组、腺病毒/蛋白组、腺病毒组的CTL杀伤活性明显高于PBS组(P<0.05);用致死量CVB3感染后,蛋白组、腺病毒/蛋白组的血中病毒滴度低于其他组,而生存率高于其他组(P(0.05).[结论]蛋白组、腺病毒/蛋白组免疫小鼠的效果明显优于腺病毒组和PBS组.
