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弓形虫Rhomboid-IL-2基因重组卡介苗的构建及其对犬的免疫效果
目的 构建弓形虫Rhomboid以及犬白介素2基因重组卡介苗,并观察其对免疫犬的免疫效果. 方法 将鉴定正确的弓形虫Rhombiod基因和犬IL-2基因一起克隆到大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体和整合表达载体中,构建重组质粒pMV261(361)-IL2-Rho.将重组质粒转入卡介苗中,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析及Western blot鉴定.分别用重组卡介苗pMV261(361)-IL2-Rho和pMV261 (361)-Rho经皮下免疫犬,检测免疫犬体液及细胞免疫水平变化并观察其存活时间. 结果 成功构建pMV261(361)-IL2-Rho重组质粒,弓形虫Rhomboid基因在重组卡介苗中稳定表达46 ku的目的蛋白,Western blot显示该蛋白能被弓形虫感染鼠血清识别.动物实验表明,rBCGpMV261(361)-IL2-Rho能诱导产生较强的体液免疫和Th1型细胞免疫应答反应,rBCGpMV361-IL2-Rho免疫组感染弓形虫后的存活时间组为(14.40±4.50)d,rBCGpMV261-IL2-Rho免疫组感染弓形虫后的存活时间组为(13.00±4.75)d,较BCG对照组存活时间(8.20±5.45)d有所延长. 结论 rBCGpMV261 (361)-IL2-Rho蛋白具有免疫原性.该重组卡介苗对犬弓形虫感染有一定保护效果.
关键词： 弓形虫 Rhomboid基因 白介素2 rBCG -
微小隐孢子虫与安氏隐孢子虫Rhomboid基因部分序列的克隆和分析
目的 获得我国微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid基因(CPRho和CARho)部分序列并确定与国外分离株相应序列的同源性.方法 应用RT-PCR技术扩增微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid基因片段,然后将其克隆到pMD18-T载体中,测得序列应用DNAMAN软件进行序列分析.结果 经RT-PCR扩增出微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid基因部分序列,大小均为723 bp.经DNA MAN软件分析,表明我国微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid核苷酸序列同源性为99.6%,氨基酸同源性为99.2%.二者与GenBank公布的相应序列核苷酸同源性分别为99.9%和99.7%,而氨基酸同源性均为99.6%.结论 获得了微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid基因部分序列,为继续研究该基因的侵入功能等奠定了基础.
关键词： 微小隐孢子虫 安氏隐孢子虫 Rhomboid基因 克隆 -
斯氏艾美耳球虫兰州株Rhomboid基因的克隆及原核表达
目的 克隆并原核表达斯氏艾美耳球虫(Eimeria stiedai,E.stiedai)兰州株Rhomboid基因.方法 通过分析基因保守区设计引物,采用RT-PCR方法与3'RACE技术相结合,扩增获得兔斯氏艾美耳球虫Rhomboid基因cDNA全序列,并对其进行序列分析；将获得的Rhomboid基因克隆至原核表达载体pET-28a中,转化E.coli Rosetta (DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE及Western blot分析.结果 Rhomboid基因开放阅读框全长774 bp,编码257个氨基酸残基,预测蛋白质相对分子质量和等电点分别为28 120和8.64,与鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tellan)Rhomboid蛋白氨基酸序列的同源性为84.44％;构建的重组原核表达质粒pET-Rhomboid经双酶切和测序证实构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量约为29 000,并可与兔抗E.stiedai阳性血清发生特异性反应.结论 成功克隆并表达了Rhomboid基因,为其生物学功能及以其作为斯氏艾美耳球虫疫苗候选基因的研究奠定了基础.
关键词： 艾美耳球虫 Rhomboid基因 RACE 原核细胞 基因表达 -
猪弓形虫重组卡介苗的构建及其免疫保护性
目的 构建弓形虫Rhomboid基因和猪IL-2基因的重组卡介苗(BCG),并分析其免疫保护效果.方法 应用RT-PCR技术分别扩增弓形虫Rhomboid基因和猪IL-2基因,克隆至pMD 18-T载体中,双酶切鉴定及测序正确后,将弓形虫Rhomboid基因和猪IL-2基因串联后分别连接至穿梭表达载体pMV261和整合表达载体pMV361中,电转化BCG,制备重组BCG pMV261-IL-2-Rho和pMV361-IL-2-Rho.分别经颈部肌肉注射免疫猪,共3次,每次间隔2周,免疫剂量均为108 CFU/只,采用ELISA法检测免疫前后猪体内抗体(IgG)滴度、Th1型及Th2型细胞因子的变化情况;第3次免疫后2周通过腹腔注射的方式接种弓形虫China I株速殖子1×108个/只进行攻虫试验,观察重组BCG对猪的免疫保护效果.结果 成功构建了重组BCG pMV261-IL-2-Rho和pMV361-IL-2-Rho.重组BCG免疫猪后,随着免疫次数的增加,血清中抗体滴度也逐渐升高,且与PBS对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.01).3次免疫后,pMV261-IL-2-Rho组血清Th1型细胞因子IL-2、IFNγ和IL-12的表达水平均明显提高,与PBS对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05),而pMV361-IL-2-Rho组血清IL-2、IFNγ和IL-12的水平虽略有升高,但与PBS对照组相比,差异无统计学意义(P＞0.05);各组在免疫过程中Th2型细胞因子IL-4水平均未发生明显变化.攻虫后各组猪出现精神沉郁,食欲下降,体温升高等症状,耐过发病期后的猪,食欲逐渐恢复,体温渐趋正常,各种症状减轻,且各组猪在攻虫后20 d均无死亡.结论 构建的基因重组BCG pMV261-IL-2-Rho对猪弓形虫感染具有一定的免疫保护作用.
关键词： 弓形虫 Rhomboid基因 IL-2基因 重组卡介苗 免疫保护
