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杆状病毒-昆虫细胞系统表达的戊型肝炎病毒衣壳蛋白p495的纯化、结构解析以及免疫原性分析
本研究目的是利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统建立戊型肝炎病毒(HEV) p495蛋白的高效稳定表达和可放大纯化的方法,研究其理化性质和解析三维结构,与上市戊肝疫苗益可宁(Hecolin)进行免疫原性的比较.本研究选择基因1型HEV毒株的开放读码框2(ORF2)的aa112-606片段构建杆状病毒,感染昆虫细胞进行重组蛋白的表达,经过PEG沉淀和阴离子交换层析的纯化,获得纯度为95％以上的p495蛋白,每升细胞培养液终获得15mg的目的蛋白.经ELISA、分析超离、分子排阻色谱和电镜负染等分析显示p495蛋白具有良好的抗原性且呈现为均一的病毒样颗粒(VLP),沉降系数为51.3S,颗粒直径约20nm.冷冻电镜三维结构解析获得分辨率为3.8A的三维结构,揭示p495形成了T=1的等二十面体结构,与已报道的晶体结构相一致.小鼠免疫实验表明p495蛋白与益可宁中p239抗原的免疫原性相当.本研究为进一步开展HEV的受体鉴定、表位结构研究以及疫苗改进等奠定良好的基础.
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TNF受体（P55）和IgG Fc的融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达
目的在真核细胞表达具有生物活性的可溶性肿瘤坏死因子（TNF）受体蛋白，用于中和TNF的毒性。方法 将TNFR（P55）的胞外区基因和人IgG Fc段基因通过18个碱基的凝血酶切点连接，克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋），在COS7和BHK细胞分别得到目的蛋白的表达。结果 在真核表达系统表达了TNFR（P55）胞外区与人IgG Fc段的融合蛋白，免疫学实验及L929细胞体外实验均表明该蛋白具有TNFR（P55）特异的抗原性、与TNF结合的活性以及抑制TNF的活性。结论 真核表达的融合蛋白产物具有可溶性TNF受体（P55）的生物学活性。
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HPV16L1真核表达系统在哺乳动物细胞中表达的实验研究
人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPVs)是引起人类皮肤、粘膜乳头状瘤或疣的一类肿瘤相关病毒,与多种肿瘤发生相关,至今尚无有效的预防方法.70年代科学家们把乳头瘤病毒(PV)分为人乳头瘤病毒(HPV)和动物乳头瘤病毒[1,2],现在已把HPV分成70余个型别,且确立了HPV与肿瘤发生的相关性;把HPV分成高危组、低危组,在高危组中以HPV16、18、31、33、58等型为代表,主要引起子宫颈癌[3]、消化道癌、骨髓瘤等[4].
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人突变CD59基因在CHO细胞的表达、检测及生物活性研究
目的:分别构建两个高效表达人突变CD59的CHO细胞真核表达系统,探讨突变CD59基因表达蛋白糖基化前后抗补体活性的变化,为在基因水平阐明糖尿病血管增殖症的发病机理奠定基础.方法:将两种含不同突变基因的人CD59全长cDNA序列(HM7、HM8)的重组pALTER质粒运用阳离子脂质体导入法共转染CHO细胞,用含有400 μg/ml新霉素类似物(G418)的F12培养基筛选出阳性表达克隆,应用荧光免疫组化(FIH)检测CD59在CHO细胞表面的表达.经染料释放试验检测突变CD59糖基化前后抗补体活性.结果:运用阳离子脂质体导入法将重组pALTER质粒与pcDNA3质粒共转染CHO,成功筛选出的阳性克隆经FIH证明突变CD59可在CHO细胞表达.染料释放法证实两种突变CD59均具有抗补体活性,且在高糖环境下易糖基化,糖基化后抗补体活性明显降低.结论:建立了两个高效表达突变CD59的真核表达系统,获得阳性克隆细胞株.初步研究证实突变CD59具有抗补体活性,糖基化后抗补体活性明显降低,为单克隆抗体的制备奠定了基础.
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CD137(人4-1BB)在dhfr-CHO中的表达及活性研究
目的:构建CD137真核高效表达系统,深入研究CD137及其配体在细胞信号转导中的作用.方法:将构建有CD137全长cDNA序列的pCDNA3质粒(CMV-ILA-SEN,CIS)及pSV2-dhfr(含二氢叶酸还原酶基因),运用脂质体介导法共转染二氢叶酸还原酶缺陷的CHO细胞(dhfr-CHO);用G418筛选出阳性克隆;MTX压力选择系统诱导CD137在dhfr-CHO细胞的高效表达;RT-PCR、免疫细胞化学法及流式细胞术测定CD137的表达情况;3H-TdR掺入法进行活性研究.结果:CD137为膜型表达,CIS转化dhfr-CHO细胞CD137表达率为96.07%;活性研究显示CD137膜蛋白轻度促进抗CD3单抗诱导的PBMC增殖.结论:获得高效表达CD137的CHO细胞株,CD137膜蛋白促进抗CD3单抗诱导的PBMC增殖.
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单个B细胞制备CRP单克隆抗体及其ELISA检测体系的初步建立
目的:用单个B细胞抗体制备技术结合Exip293真核表达系统制备hs-CRP单克隆抗体.方法:用重组CRP蛋白免疫小鼠,荧光标记探针和流式分选技术分离出表达CRP单克隆抗体的单个B细胞,通过PCR方法扩增出编码CRP单克隆抗体蛋白的轻重链核酸序列并构建重组质粒,质粒转染到Expi 293细胞中制备出单克隆抗体蛋白.结果:用间接ELISA法筛选出两个具有良好特异性的单克隆抗体20#,22#,将这两个抗体配对并建立ELISA双抗体夹心检测方法,CRP浓度在15～250 ng/ml范围内有较好的检测线性(y=0.003x-0.0358,R2=0.9974),精密度分析的批内变异系数CV为6.7％ ～9.37％,批间变异系数为8.52％ ～9.10％,平均回收率为98％,与临床血清检测值具有良好的相关性,达到CRP检测要求.结论:本研究所用的单个B细胞分离分选方法结合Expi 293真核表达系统在制备单克隆抗体方面具有省时、高效、特异性好、灵敏度高的特点,具有很好的应用价值.
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葡萄球菌肠毒素B基因真核表达系统的构建及目的蛋白的鉴定
目的克隆葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因,构建其真核表达系统并表达目的蛋白.方法采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌FRIS6B株中扩增全长SEB,目的片段T-A克隆后测序.重组质粒pUCm-T-SEB经酶切获得的pUCm-T-SEB基因片段与真核表达载体pPIC9K连接.将重组真核载体pPIC9K-SEB转化入P.pastoris GS115株,经PCR筛选并鉴定pPIC9K-SEB-P.pastoris GS115.在0.5%(v/v)甲醇诱导下,采用SDS-PAGE检测重组SEB(rSEB)的表达,并对rSEB的N端氨基酸序列和诱导人脐静脉内皮EVC-304细胞分泌IL-1α和TNFα的作用进行了检测.结果所克隆的SEB基因核苷酸及氨基酸序列的同源性分别高达98.84%～100%和100%.表达的SEB在SDS-PAGE图谱的位置与预期相符.rSEB氨基末端氨基酸序列与预期完全相符.rSEB与SEB商品有相似的促人脐静脉内皮细胞EVC-304分泌IL-1α和TNFα的活性.结论已成功地构建了SEB的真核表达系统,为进一步分析SEB分子中毒性相关活性位点、定位突变获得减毒或无毒的突变体奠定了基础.
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β-NGF在真核细胞蛋白表达系统中的表达及活性鉴定
目的:得到较高表达,且表达产物具有良好生物学活性的神经生长因子.方法:将神经胶丙原β-NGF基因克隆于DNA转移载体pBacPAK8中,获得重组DNA转移载体pBacPAK-NGF,与线性化Bm-BacPAK6修饰病毒基因组DNA共转染Bm-N细胞,经过体内重组,筛选到重组病毒.用重组病毒感染家蚕幼虫,经SDS-PAGE检测及利用PC12细胞进行NGF生物活力测定.结果:感染重组病毒BmNPV-NGF5天的家蚕血淋巴有一条与天然NGF单体分子易相近的蛋白组分,旦有类似于小鼠2.5gNGF的活性.结论:神经生长因子在家蚕幼虫中得到较高表达,且表达产物具有良好的生物学活性.
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鼠神经菌毛素1蛋白的真核表达及其鉴定
目的 制备重组鼠神经菌毛素1(mNRP1)蛋白.方法 将表达载体pCMV3-mNRP1-flag(pCMV-mNRP1)转化大肠杆菌DH5α感受态,扩增重组质粒;随后将pCMV-mNRP1转染哺乳动物细胞株HEK293,间接免疫荧光法(IrA)及western blot法鉴定重组蛋白mNRP1(flag-mNRP1)的表达.结果 IFA及western blot结果显示重组质粒转染HEK293后,flag-mNRP1获得有效表达,融合蛋白相对分子质量约为120000.结论 重组蛋白mNRP1在真核表达系统中获得成功表达,该蛋白的获得为进一步研究NRP1的生物学功能提供有效的生物材料.
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H7N9禽流感病毒HA2基因真核表达与免疫原性初步研究
目的 利用真核表达载体构建H7N9禽流感病毒血凝素刺突茎部(HA2)的真核表达质粒,在293F细胞中表达HA2蛋白,并初步探讨其免疫原性.方法 根据pMD18-T-HA中的序列设计H7N9禽流感病毒HA2扩增引物,在下游引物中引入胰酶酶切位点;目的基因经特异性酶切位点克隆入自身带有Fc标签的pFUSE-IgG1-Fc1载体,构建重组质粒HA2-Fc;将重组质粒转染293F细胞,通过间接免疫荧荧光(IFA)和免疫印迹法(WB)鉴定HA2蛋白的表达和免疫原性.结果 成功构建H7N9禽流感病毒HA2基因真核表达质粒HA2-Fc,并在293F细胞中表达出分子量大约为50 kDa的重组蛋白.IFA和WB显示该蛋白与抗H7N9病毒鼠多抗具有良好的免疫反应.结论 成功构建表达HA2亚单位的真核表达系统,重组蛋白具有较高的免疫原性,为筛选H7N9广谱疫苗候选分子、广谱中和抗体,及深入研究其致病机理和免疫机制奠定基础.
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华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶两种表达方式的比较
目的 比较原核和真核2种表达系统重组表达华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶方法的优劣和目的产物的血清免疫学检测效果.方法 根据已知的华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶序列分别设计引物扩增目的基因,与相应的表达载体相连分别构建原核表达质粒pET28a-CP和真核表达质粒pPIC9K-CP,双酶切及测序鉴定后,将正确的重组质粒分别转入大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)和毕赤酵母GS115中诱导表达、纯化；将获得的纯化蛋白采用ELISA方法检测华支睾吸虫病人血清和正常人血清,比较诊断效果.结果 原核表达系统表达的华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶以包涵体形式存在,表达量为6.84mg/L;真核表达系统表达量达到65.00mg/L,且为可溶性蛋白；两者检测华支睾吸虫病的敏感性分别为95.00％ (57/60)和93.30％ (56/60),特异性分别为91.67％(77/84)和94.10％(79/84),差异均无统计学意义(P均＞0.05).结论 真核表达华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶较原核表达系统具有更高的应用价值.
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真核表达系统的研究进展
真核表达系统具有翻译后的加工修饰体系,表达的外源蛋白更接近于天然蛋白质.基因工程中常用的真核表达系统有:酵母表达系统、昆虫细胞表达系统及哺乳动物细胞表达系统.甲醇酵母主要利用醇氧化酶的基因启动子在甲醇诱导下表达外源蛋白,而三磷酸甘油脱氢酶启动不需甲醇诱导,可缩短到达峰值表达的时间.杆状病毒是昆虫细胞表达系统中常用的表达载体,利用转座原理构建重组杆状病毒是一种有效的构建重组体的方法;杆状病毒-S2系统是近构建的一种不裂解宿主细胞的新型昆虫细胞表达系统.哺乳动物细胞表达系统中,腺病毒是常用的表达载体,通过细菌内同源重组和Cre/loxp系统构建重组体,可提高重组效率;利用杆状病毒将外源基因导入哺乳动物细胞,不会引起病毒基因的表达;四环素诱导表达系统是目前应用广泛的哺乳动物细胞诱导表达系统,该系统具有严密、高效、可控性强的特点.
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人源抗TROP2全分子抗体IgG的真核表达及对胰腺癌细胞增殖的抑制作用
目的:以人源抗TROP2抗体Fab基因为模板,构建人源抗TROP2全分子抗体IgG真核表达系统,观察人源抗TROP2全分子抗体IgG对胰腺癌细胞增殖的抑制作用.方法:分别扩增抗TROP2抗体的重链和轻链基因,构建人源抗TROP2全分子抗体IgG的重组表达载体pWS-anti-TROP2,转染CHO dhfr-细胞,加MTX筛选抗体表达量高的单克隆株,Protein G亲和柱纯化,获得人源抗TROP2全分子抗体IgG.SDS-PAGE、Western blot、ELISA、免疫荧光和流式细胞术等方法鉴定人源抗TROP2全分子抗体IgG并分析其免疫学活性.MTT法分析人源抗TROP2全分子抗体IgG对胰腺癌细胞BxPC-3的增殖抑制作用.结果:成功构建了人源抗TROP2全分子抗体IgG的真核表达系统,表达并纯化人源抗TROP2全分子抗体IgG.经鉴定,抗体的轻链与重链大小与预期一致,可与TROP2蛋白特异性结合,效价可达1:6 400.MTT检测结果表明,人源抗TROP2全分子抗体IgG对胰腺癌BxPC3细胞的增殖有明显的抑制作用,且呈时效、量效依赖关系.结论:本研究成功构建了人源抗TROP2全分子抗体IgG的真核表达系统,并证明此抗体可特异性识别胰腺癌细胞表面的TROP2蛋白,且对胰腺癌细胞的增殖有明显的抑制作用.
关键词： TROP2 真核表达系统 CHO dhfr-细胞 胰腺癌 -
抗扎伊尔型埃博拉病毒单克隆抗体的制备和鉴定
目的 采用扎伊尔型埃博拉病毒核蛋白(EBOV NP)的合成多肽为免疫原制备鼠源单克隆抗体,并用4种埃博拉流行株核蛋白基因的真核表达蛋白对制备的单克隆抗体进行特异性分析.方法 用人工合成的扎伊尔型埃博拉病毒核蛋白多肽免疫动物,进行细胞融合后筛选阳性杂交瘤细胞.构建埃博拉病毒4种亚型的真核表达载体转染HEK293T细胞以表达目的蛋白,再以真核表达蛋白为抗原,用免疫印迹方法分析扎伊尔型埃博拉病毒单克隆抗体的特异性.结果 完成了抗扎伊尔型单克隆抗体的制备,共得到能分泌抗扎伊尔型埃博拉病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞12株,小鼠腹水抗体效价介于1:104～1:105,其中3株杂交瘤细胞株分泌的抗扎伊尔型埃博拉病毒单克隆抗体与其他3种亚型无交叉反应,抗体效价高、特异性好.结论 成功制备抗扎伊尔型埃博拉病毒单克隆抗体,为建立快速检测埃博拉病毒的方法奠定基础.
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重组可溶性人CD137在CHO细胞中的表达
目的:获得表达人可溶性CD137抗原的dhfr-CHO细胞株.方法:将CD137-hIgG1Fc-pCD-NA3重组质粒及pSV2-dhfr质粒,运用脂质体介导法共转染CHO细胞.用G418筛选出阳性克隆,MTX递增浓度诱导人可溶性CD137在dhfr-CHO细胞的表达.运用RT-PCR检测CD137 mRNA转录水平,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测人CD137可溶性蛋白在CHO细胞中的表达.结果:重组质粒转化细胞进行RT-PCR后,得到一大小为558bp的特异性条带,与人CD137胞膜外区一致;重组质粒转化细胞进行SDS-PAGE得到一大小约为37KDa的条带,与人CD137-hIgG1Fc融合蛋白大小基本一致.结论:获得了表达人可溶性CD137的dhfr-CHO细胞株,为获得纯化的CD137抗原、制备CD137单抗奠定了基础.
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重组人β-防御素-2基因在昆虫细胞的转染表达
目的:BEVS(Baculovirus expression vector system)杆状病毒表达系统是近年涌现的适用范围广、表达效率高的真核表达系统之一.本研究旨在探索应用该系统高效表达hBD-2的可行性及技术路线.方法:(1)利用引物hBD2p6和hBD2p9经PCR扩增,从原质粒的pcDNA3.1/Myc-His(+)/hBD-2中扩增出带有翻译起始密码ATG和终止密码TGA的完整重组hBD-2/His基因片段,通过双酶切,使该片段两端分别带有ScaI和KpnI两种限制性内切酶粘性末端;将此外源性片段插入转移质粒pAcGHLT-A的多克隆位点中的ScaI和KpnI位点上,使其处在多角蛋白基因强启动子的控制之下.(2)经重组pAcGHLT-A/hBD-2/His转移载体和AcNPV DNA共转染Sf21细胞,并在细胞内进行同源重组,形成重组病毒rAcNPVhBD-2/His.于共染后第5 d,收集各组细胞的培养上清,用终点稀释分析法检测共转染效率.经过多轮感染上清反复感染Sf21细胞和终点稀释分析法验证,获得高滴度的重组病毒.(3)用特异性抗-His抗体,经Western blot检测细胞及上清hBD-2/His的表达情况.结果:经酶切鉴定和测序分析证实:C端带Myc和6个多聚组氨酸双重标志的重组hBD-2已正确地插入BEVS系统的转移载体中,构建成重组转移载体pAcGHLT-A/hBD-2/His.经过多轮感染上清反复感染Sf21细胞及终点稀释分析法验证,高滴度的重组病毒rAcNPVhBD-2/His已被获得.Western blot检测结果提示Sf21细胞已表达和分泌6xHis-GST-hBD-2-6xHis融合蛋白.结论:本研究结果支持利用BEVS杆状病毒-昆虫表达系统作为高效表达重组hBD-2生物反应器的设想.
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SARS-CoV S1蛋白在甲醇营养型酵母中表达及鉴定
目的获得保持生物学活性、易于纯化、高产量的严重急性呼吸道综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrom coronavirus,SARS-CoV)S1蛋白,以便进一步研究S1蛋白及其抗体的功能.方法将SARS-CoV S1基因重组入酵母表达载体pMETαA,经过酶切和测序鉴定后,通过电穿孔法将重组质粒S1-pMETαA转化入宿主酵母菌株PMAD11,使其在甲醇的诱导下表达目的蛋白.后用覆盖分析法对重组转化子初步分析,SDS-PAGE和Wesntern blotting法鉴定目的蛋白的表达和特异性.结果酶切鉴定和测序结果证实了S1基因成功地克隆到pMETαA载体中;覆盖分析、SDS-PAGE和免疫印迹法证实S1基因得到正确的表达.结论利用酵母表达系统,成功地克隆和表达了SARS-CoV S1蛋白,为进一步纯化该蛋白和研究其功能奠定了基础.
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慢病毒介导的H7N9禽流感病毒血凝素基因快速真核表达系统的建立
目的 利用慢病毒载体构建新型H7N9禽流感病毒血凝素(HA)基因的快速真核表达体系,在人胚肾细胞(HEK293T)中表达并进行功能鉴定.方法 提取H7N9禽流感病毒基因组RNA,采用反转录PCR技术扩增HA读码框全长基因,将HA基因连接pMD18-T载体构建pMD18-T-HA重组载体.设计含Kozak序列的引物从pMD18-T-HA质粒中扩增出平末端HA基因,采用Topo克隆构建表达载体pLenti-HA-V5.将表达载体转染HEK293T细胞,通过间接免疫荧光法(IFA)和Westernblot法鉴定HA蛋白的表达,通过血凝实验鉴定重组蛋白的生物学活性.结果 经反转录PCR获得1 683 bp的HA全长基因,完成真核表达载体的构建并表达出相对分子质量(Mr)为70 000的重组蛋白.IFA和Western blot法结果显示该蛋白与阳性血清具有良好的免疫反应,同时血凝实验证实其具有血凝活性.结论 成功利用慢病毒载体建立了HA蛋白的快速真核表达系统,为研制H7N9病毒亚单位疫苗、中和表位研究、假病毒包装奠定基础.
