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壁虎醇提物体外诱导人前列腺癌PC-3细胞凋亡及机制研究
目的:研究壁虎醇提物(GAE)体外诱导激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞凋亡作用及其可能机制,为激素非依赖性前列腺癌的治疗提供理论依据.方法:以前列腺癌PC-3细胞为研究对象,MTT法检测3.5,4.0,4.5,5.0,5.5 g·L-1GAE作用细胞24,48,72 h后对激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞增殖抑制作用;3.5,4.0,5.0 g·L-1的GAE作用48 h后,另设空白组,Hoeehst33342荧光染色法,AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡,SP免疫组化法检测细胞内半胱氨酸蛋白酶3(Caspase 3)和Fas的表达情况并做统计学处理.结果:3.5,4.0,4.5,5.0,5.5 g·L-1 GAE作用细胞24,48,72 h后能显著抑制PC-3细胞的生长且呈剂量和时间依赖性;与空白组比较,3.5,4.0,5.0 g·L-1的GAE作用48 h后Hoeehst33342荧光染色发现部分PC-3细胞发生典型的凋亡形态学改变;Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测显示3.5,4.0,5.0 g·L-1的GAE作用48 h后,早期凋亡细胞分别占6.51％,12.48％和22.81％,且免疫组化显示细胞内蛋白Caspase-3和Fas的表达均上调且呈浓度依赖性(P＜0.05).结论:GAE能够诱导激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞凋亡,其作用机制可能与死亡受体介导的信号通路有关.
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黄芪对新生鼠乏氧缺血脑损伤海马区神经保护作用的研究
目的:探讨新生儿乏氧缺血脑损伤(HIBD)后,脑细胞损伤的机制和黄芪对海马区的神经保护作用.方法:用新生大鼠建立新生儿HIBD的模型,于缺氧后不同时间点取脑,分别行组织病理学检查并计数海马CA1区神经细胞死亡率、半定量逆转录-聚合酶反应(RT-PCR)检测caspase-3(天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶-3)mRNA表达、三等分迷宫测试成熟大鼠学习记忆能力.分Sham组、模型组、黄芪治疗组观察并对比上述指标.结果:模型组结扎侧海马caspase-3 mRNA表达于HI后6 h轻度升高,24 h达高峰,48 h后下降,5 d和7 d时恢复至基础水平.黄芪组HI后结扎侧海马神经细胞死亡率明显降低、caspase-3 mRNA的表达峰值降低了44%～46%(mRNA),成熟大鼠的学习记忆能力明显提高.结论:黄芪对未成熟脑HIBD后海马部位有明显的神经保护功能,此功能与抑制caspase-3的表达有关.
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人参皂苷Rg_1对AD模型大鼠脑片P-Tau,caspase-3表达的影响
目的:研究人参皂苷Rg_1对AD模型大鼠脑片磷酸化Tau蛋白(Phosphory protein Tau,P-Tau)、半胱氨酸蛋白酶(caspase-3)表达的调控作用.方法:将5周龄的雄性Wistar大鼠脑片(含海马及皮层)随机分为5组:空白对照组,模型组,人参皂苷Rg,低、中、高(60,120,240 μmol·L~(-1))3个浓度组,每组10张脑片.脑片放置人工脑脊液中培养.人参皂苷Rg_1预防性加入人参皂苷Rg_1各组2 h后,模型组和人参皂苷Rg_1各组分别加入用冈田酸(okadaic acid,OA)3 h,诱导大鼠脑片Tau蛋白过度磷酸化制备AD模型,运用免疫组织化学、图像分析技术等方法,观察人参皂苷Rg_1预防性干预对各组大鼠脑片P-Tau,caspase-3表达的影响.结果:模型组P-Tau,caspase-3的表达水平明显高于空白对照组(P<0.01);人参皂苷Rg_1低、中、高浓度组与模型组比较,P-Tau,caspase-3的表达水平明显降低(P<0.01或P<0.05);P-Tau,caspase-3的表达随着人参皂苷Rg_1浓度增加而降低.结论:人参皂苷Rg_1可以降低P-Tau水平,从而减缓神经纤维缠结的形成;还可通过抑制凋亡效应蛋白caspase-3的表达,从而抑制神经元凋亡,保护神经细胞,发挥抗痴呆的作用.
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黄芪对新生鼠缺氧缺血脑损伤后皮质的治疗作用
目的探讨新生儿围产期缺氧缺血脑损伤(hypoxia-ischemia brain damage,HIBD)时皮质区神经细胞损伤的机制和黄芪对皮质区的神经保护作用.方法建立新生大鼠HIBD模型,分假手术组(Sham组)、模型组、黄芪治疗组.于缺氧后不同时间点取脑,分别行组织病理学检查并计数皮质区神经细胞死亡率、免疫组化检测结扎侧皮质区半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)蛋白的表达、半定量逆转录-聚合酶反应(RTPCR)检测caspase-3 mRNA表达.结果模型组结扎侧皮质caspase-3 mRNA和蛋白表达于缺氧缺血(HI)后6h轻度升高,24h达高峰,48h后下降,5天和7天时恢复至基础水平.黄芪治疗组HI后结扎侧皮质神经细胞死亡率明显降低、caspase-3 mRNA和蛋白的表达峰值降低了45%(mRNA)、40%～43%(蛋白).结论黄芪对未成熟脑HIBD后皮质部位有明显的神经保护功能,此功能与抑制caspase-3的表达有关.
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Caspase 8的多样性表达与伤口愈合
半胱氨酸蛋白酶 8(caspase 8)先前被认为只与细胞凋亡有关,但Jamora等揭示表皮caspase 8的表达水平在伤口愈合过程中存在较大的波动.他们通过原位杂交发现接近伤口的部位,表皮增厚并伴有caspase 8 RNA水平的下调.
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曼氏迭宫绦虫半胱氨酸蛋白酶体外表达条件的优化
目的 优化曼氏(欧猥)迭宫绦虫半胱氨酸蛋白酶(Spirometra erinaceieuropaei cysteine protease,SeCP)基因的体外表达条件. 方法 对含有SeCP基因重组表达质粒pMAL-c2X-SeCP的大肠埃希菌TB1在不同培养温度、不同诱导剂异丙基硫代β-D-半乳糖苷(isopropyl-1-thio-β-galactopyranoside,IPTG)浓度及不同培养时间等条件下进行诱导表达,通过SDS-PAGE与蛋白图谱扫描分析重组SeCP蛋白(rSeCP)的表达水平,选择rSeCP适宜的体外表达条件. 结果 SDS-PAGE显示重组质粒pMAL-c2X-SeCP转化大肠埃希菌TB1在常规诱导条件(培养温度30℃,1 mmol/LIPTG诱导培养4h)下,rSeCP以可溶性蛋白和包涵体2种形式表达.当重组菌TB1在28、30、31、32、34、35及37℃条件下培养时,rSeCP的表达量分别占全菌上清蛋白量的9.4％、15.1％、12.2％、6.6％、6.4％、5.4％和1.2％;当重组菌TB1在30℃条件下IPTG终浓度0.1、0.2、0.5及1.0 mmol/L诱导时,rSeCP表达量分别占全菌总蛋白量的32.6％、25.7％、26.7％和25.7％;当重组菌TB1在30℃条件下IPTG终浓度0.1 mmol/L诱导培养1、2、3、4、5和6h,rSeCP的表达量分别占全菌总蛋白量的13.4％、18.6％、22.4％、33.2％、45.2％和34.6％. 结论 培养温度为30℃,IPTG终浓度为0.1 mmol/L诱导培养5h,为重组质粒pMAL-c2X-SeCP转染大肠埃希菌TB1表达rSeCP佳条件,该研究为大量制备和纯化rSeCP奠定了基础.
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华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶ELISA检测方法的建立及其应用效果评价
目的 建立重组华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶ELISA检测方法,观察该方法检测华支睾吸虫病的现场应用效果. 方法 根据江苏省第二次重要人体寄生虫流行现状调查结果选取6个调查点,采用整群抽样的方法每个村调查不少于500人,应用重组华支睾吸虫半胱氨酸ELISA检测血清特异性抗体.采用系统抽样方法抽取的10％o的阴性者和全部阳性者开展病原学检测.ELISA试验通过设立阴性血清、阳性血清和PBS对照及重复试验进行质量控制. 结果 ELISA检测3 105人,血清特异性抗体阳性21人,阳性率为0.68％.对ELISA阳性者做病原学检查,阳性18人,一致率为99.10％.质量控制结果显示ELISA试验,每批次阴性和阳性平行对照A450均值差异无统计学意义(P＞0.05),重复试验一致率为99.43％. 结论 重组华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶ELISA法重复性好,敏感性高,具有较高的诊断价值和广阔的应用前景.
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斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶基因pET22b载体的构建及表达
目的构建含斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶基因片段的pET22b(+)表达载体,利用SDS-PAGE和免疫印迹分析阳性克隆菌株的诱导表达及其表达产物的免疫原性.方法提取斯氏狸殖吸虫成虫总RNA,经RT-PCR扩增及T/A克隆后测定其核苷酸序列并进行序列查询与比对.根据已获得的序列和pET22b(+)载体的内切酶位点信息设计引物并再次进行T/A克隆,阳性克隆质粒经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后将目的片段与pET22b(+)载体连接并转化至BL21(DE3)菌株,收集经IPTG诱导表达后的菌液进行SDS-PAGE和免疫印迹分析.结果 SDS-PAGE显示,经诱导表达的阳性克隆菌株、未经诱导菌株与空载体菌株之间的蛋白带型未见明显差异,但经诱导表达的阳性克隆菌株的22 ku蛋白条带比另两菌株明显,免疫印迹证实,该蛋白条带可与斯氏狸殖吸虫成虫ES抗原免疫豚鼠血清发生强阳性反应.结论成功构建了含斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶基因的pET22b(+)载体,经诱导表达的融合蛋白能与斯氏狸殖吸虫成虫ES抗原免疫豚鼠血清发生较强的免疫反应.
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PARP-1抑制剂对细胞周期特异性毒物诱导的骨肉瘤细胞凋亡的影响
目的 探讨PARP抑制剂BMN-673在替尼泊苷(VM-26)诱导的MG-63细胞增殖及凋亡中的作用.方法 采用常规方法培养MG-63细胞,经BMN-673和(或)ABT-888处理12h后,采用MTT比色法分析细胞的活力,采用流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法分析细胞凋亡水平,采用ELISA试验与细胞中半胱氨酸蛋白酶活性.结果 BMN-673与VM-26联用组、对照组及VM 26单独使用组细胞活力分别为58.00％、97.00％和77.00％,差异有统计学意义(P＜0.05);细胞凋亡水平分别为42.00％、3.00％和23.00％,差异有统计学意义(P＜0.01);细胞中Caspase-3、Caspase-6和Caspase-9活性分别为12.1 5％、8.28％和9.09％,5.25％、2.51％和3.12％,2.89％、0和0.98％,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 PARP抑制剂BMN-673可通过抑制PARP-1活性,进而抑制细胞DNA损伤修复,来增强MG-63细胞对抗癌药物VM 26的药敏性,为骨肉瘤化疗药物的临床研究了提供新的思路.
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钙蛋白酶小亚基1在细胞凋亡、细胞周期及肿瘤中作用机制的研究进展
钙蛋白酶(calpain)是一种存在于动物细胞中的钙离子依赖性的中性半胱氨酸蛋白酶.钙蛋白酶小亚基1(calpain-s1,capn4)作为 calpain的调节小亚基,对细胞周期、细胞凋亡及肿瘤的发生、发展等具有一定的影响.本文就近年来有关capn4在细胞周期、细胞凋亡及肿瘤中的作用机制作一综述.
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犬急性心肌缺血后左室功能变化与心肌细胞凋亡
目的观察犬急性心肌缺血后左心室壁动度、射血功能、细胞凋亡与心肌组织中caspase 3活性的变化.方法犬30只随机分为实验组15只及对照组15只,实验组结扎左冠状动脉前降支近端,结扎时间分别为10 min、30 min、60 min,每一时间点5只,对照组游离左冠状动脉前降支近端,不结扎.心肌组织行三苯四氮唑(TTC)染色,梗死区为黄白色,非梗死区为砖红色.超声心动图测定左室前壁增厚率及左心室射血分数,原位末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素脱氧尿嘧啶核苷酸缺口末端标记法(TUNEL)检测梗死区心肌组织凋亡细胞数,行caspase 3活性测定.结果 TTC染色示左室前壁及部分前间隔染色为黄白色,其余区域为砖红色.实验组冠脉结扎后10 min,左室前壁增厚率降低,与对照组比较有显著性差异(P<0.05).左心室射血分数未发生明显改变,与对照组比较无显著性差异(P>0.05).冠脉结扎后30 min至60 min,前壁增厚率降低与左心室射血分数进一步下降,与对照组比较有非常显著性差异(P<0.01).实验组冠脉结扎后10 min,梗死区心肌TUNEL阳性细胞数与对照组比较无显著性差异;冠脉结扎后30 min至60 min,梗死区心肌TUNEL阳性细胞数明显增加,与对照组比较有非常显著性差异(P<0.01).实验组冠脉结扎后10 min,梗死区心肌caspase 3荧光值升高,与对照组比较有显著性差异(P<0.05).30 min至60 min梗死区心肌caspase 3荧光值明显升高,与对照组比较有非常显著性差异(P<0.01).结论急性心肌缺血后早期,促凋亡基因caspase 3激活,缺血心肌细胞凋亡可能为急性心肌缺血的早期病理改变,并且与心肌室壁动度与左室收缩功能降低有一定关系.
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对读者来信的反馈
编辑部老师： 李丽等读者就《儿童透射比浊法血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C参考区间的建立及其与年龄、性别的相天性》一文来信，他们对儿童检验指标参考区间建迂时检测方法和参考个体的选择提出了建设性的意见和建议,我们深表感谢.
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Caspase与病毒感染关系研究进展
Caspase(cysteinyl aspartate specific proteinase)是一类特异性裂解天门冬氨酸残基的半胱氨酸蛋白酶大家族,它是各种生理和病理的刺激下引起细胞凋亡进入终末途径的始动子和执行者.本文就Caspase的生物学特性以及与病毒感染的关系作一综述.
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组织蛋白酶S、K和胱抑素C在压力负荷性心肌肥厚大鼠左心室重构中的表达
目的 探讨组织蛋白酶S(Cat S)、组织蛋白酶K(Cat K)和胱抑素C在压力负荷性心肌肥厚左心室重构过程中的表达及其相互关系.方法 雄性Wistar大鼠60只被随机分配到4周假手术组(F4)、8周假手术组(F8)、4周手术组(T4)以及8周手术组(T8).采用腹主动脉缩窄法构建心肌肥厚模型和心力衰竭模型.用实时荧光定量PCR和免疫组化法分别检测Cat S、Cat K和胱抑素C mRNA及蛋白表达,用Masson染色法分析左心室肌间质和血管周围纤维化程度,心脏超声和血流动力学测定心功能和心室重构.结果 实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)结果显示T4组大鼠心肌中的Cat S、Cat K及胱抑素C mRNA的表达均明显高于F4组大鼠(均P<0.05).T8组大鼠心肌中的Cat S、Cat K mRNA的表达进一步升高,显著高于Fs组(P<0.01),而T8组大鼠心肌中的胱抑素C mRNA的表达则降至正常水平.增高的Cat S、Cat K及胱抑素C蛋白主要表达于心肌细胞.结论 Cat S、Cat K和胱抑素C参与了压力负荷性心肌肥厚左心室的重构.
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丹芍化纤方对体外大鼠肝细胞增生、Caspase-3mRNA及白蛋白合成的影响
目的:探讨丹芍化纤方抗肝纤维化的作用机制.方法:采用Ⅳ型胶原酶消化及Ficoll密度梯度离心的方法,分离、培养大鼠肝细胞,加入5%、10%、20%药物血清干预体外培养的肝细胞,用MTT法测定肝细胞的增生,荧光实时定量PT-PCR(Real Time RT-PCR)法检测肝细胞内天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)mRNA表达,并检测培养上清中的白蛋白.结果:丹芍化纤方药物血清对肝细胞的增生及白蛋白合成有促进作用,能显著下调肝细胞内caspase-3mRNA的表达,其表达水平与正常大鼠血清组比较有显著性差异,呈明显的浓度依赖关系.结论:丹芍化纤方发挥抗肝纤维化作用与其促进肝细胞增生、蛋白合成功能,抑制肝细胞凋亡有关.
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消瘢方对体外CCl4损伤大鼠原代肝细胞保护作用的研究
目的:探讨消瘢方抗肝纤维化作用的机理.方法:采用Ⅳ型胶原酶消化及Hcoll密度梯度离心的方法,分离、培养大鼠肝细胞,先加入5%、10%、20%药物血清干预体外培养的肝细胞24 h,再用四氯化碳(CCl4)蒸熏法制造肝细胞损伤模型.分别用MTT法及荧光实时定量RT-PCR法检测CCl4损伤后肝细胞的增殖、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)mRNA表达,并检测细胞培养上清中的谷草转氨酶(AST)活性.结果:消瘢方药物血清能显著地促进CCl4损伤后肝细胞的增殖(P＜0.05,P＜0.01).CCl4损伤模型肝细胞内有一定量的caspase-3mRNA表达(6.96±0.69 ng),加5%、10%、20%正常大鼠血清干预后,肝细胞caspase-3mRNA的表达(6.31±0.64,6.01±0.68,5.54±0.58 ng)稍低于CCl4损伤模型,加5%、10%、20%消瘢方药物血清干预后,肝细胞caspase3mRNA的表达(5.51±0.72,4.87±0.45,3.08±0.82 ng)显著下调(P＜0.05,P＜0.01).CCl4损伤模型肝细胞培养上清中AST活性为1203.91±86.85 nkat,加5%、10%、20%正常大鼠血清干预后,其培养上清中AST活性降低为1092.39±57.01,1025.54±29.17,996.03±53.68 nkat,加5%、10%、20%消瘢方药物血清干预后,其培养上清中AST活性(998.70±30.67,885.51±44.82,753.48±35.17nkat)显著降低(P＜0.05,P＜0.01).消瘢方药物血清对CCl4损伤后肝细胞增殖的影响、下调肝细胞caspase-3mRNA的表达及降低肝细胞培养上清中AST活性的作用,均呈明显的血清浓度依赖关系.结论:消瘢方抗肝纤维化机理与其保护肝细胞免受损害、抑制肝细胞凋亡有关.
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HBsAg结合蛋白C-12基因转染肝癌细胞的基因表达谱芯片分析
目的:为研究未知功能的乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)结合蛋白C-12的生物学功能,我们应用基因芯片技术对于C-12转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析,探索该基因表达对细胞基因表达的影响.方法:应用酵母双杂交技术筛选并验证HBcAg的肝细胞结合蛋白基因.反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从HepG2细胞中扩增C-12蛋白编码基因片段,经测序鉴定后构建表达载体pcDNA3.1(-)-C-12.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.结果:筛选出肝文库中HBcAg结合蛋白新基因C-12,构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定正确.提取转染细胞的总mRNA并逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1159个基因表达谱的筛选中,发现有16个基因表达水平显著下调,包括胰岛素受体、丝氨酸/半胱氨酸蛋白酶抑制剂、SUMO-1活化酶亚基1、肿瘤易感基因101、磷酸硒合成酶2(SPS2)、caspase 4凋亡相关半胱氨酸蛋白酶4、急性淋巴细胞性白血病易位子T、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、DEAD box蛋白多肽21、前折叠素5(Prefoldin 5)、丝氨酸棕榈酰转移酶、G蛋白通路抑制剂、肿瘤坏死因子受体相关蛋白、转化生长因子β1、ADP-核糖基转移酶及1个未知蛋白基因;1个未知功能蛋白编码基因的表达水平显著上调.结论:C-12基因的表达对于肝癌细胞基因表达谱有显著影响,基因表达谱芯片技术是探索基因功能的有效技术途径,实验结果为进一步阐明C-12与HBcAg结合后的肝细胞生物学变化提供了有力的依据.
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MMP-2与宫颈癌
肿瘤的浸润与转移是恶性肿瘤的主要生物学特征,而细胞外基质(ext racell mat rix,ECM)的降解是肿瘤侵蚀正常组织和开始转移的信号及重要途径.细胞外基质的降解主要依靠蛋白水解酶,蛋白水解酶分为6类:脯肽酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、糖苷酶和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,简称MMPs）.(MMPs),MMPs是其中较为重要的一类,现已发现26余种金属蛋白酶,其中金属蛋白酶-2在肿瘤的浸润和转移中起了关键作用.
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组织蛋白酶K与骨质疏松的研究进展
骨质疏松是以骨量减少,骨组织显微结构退化(松质骨骨小梁变细、断裂、数量减少,皮质骨多孔、变薄)为特征,以致骨的脆性增高及骨折危险性明显增加的一种全身性疾病[1].骨量的丢失是由于骨吸收对骨的破坏作用超过了骨形成,由此造成骨破坏活动绝对或相对增加,从而破坏了骨重建的动态平衡过程.组织蛋白酶K是一种半胱氨酸蛋白酶,当破骨细胞施行骨吸收时会大量表达,该酶具有分解多种骨基质的作用:如对Ⅰ型胶原,Ⅱ型胶原,骨桥蛋白及骨连接素等.组织蛋白酶K在骨重建中具有重要作用.笔者对组织蛋白酶K与骨质疏松相关研究的进展作一综述.
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组织蛋白酶B的生物学特性和病理学意义
蛋白水解酶(protase)是维持机体内环境平衡的重要酶系,包括基质金属蛋白酶(MMPs)、丝氨酸蛋白酶(serine proteinases,SP)、半胱氨酸蛋白酶(cysteine proteinases,CP)和天冬氨酸蛋白酶(aspartic proteinases,AP)四大类.
