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基因重组幽门螺杆菌HspA-Zot融合蛋白质口服疫苗的研制
目的制备幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位(HspA)和霍乱弧菌封闭小带毒素(Zot)的重组融合蛋白质HspA-Zot(HZ);观察融合蛋白HZ经口服免疫后在小鼠小肠内的吸收情况;观察HZ经口服免疫后诱发小鼠产生的特异性免疫应答反应.方法①用PCR方法扩增HspA和Zot两个目的基因片段,将它们分别克隆至pSK(+)质粒上,然后插入含T7启动子pET-28a(+)的表达载体中,构建含双基因的表达质粒pET-hz,转化E,coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达高效的融合蛋白HZ;②融合蛋白经镍离子柱纯化、复性后,与HspA重组蛋白质共同标记同位素125I,经小鼠灌胃实验观察其在小鼠小肠内的吸收情况.结果①经测序,hspA-zot(hz)融合基因片段由1 575bp组成,为编码515个氨基酸残基的多肽.经SDS-PAGE检测发现,融合基因表达的蛋白质相对分子质量(M)r约为65×103.②标记同位素125I的HZ和HspA,经小鼠灌胃实验观察不同时间段的吸收情况,结果发现在5～10min时间段,HZ组出现吸收峰值,约为对照组的8.65倍(P＜0.001),且吸收峰值时间明显提前.结论融合蛋白质HZ经口服后可以在小鼠小肠内迅速被大量吸收,经口服免疫后可以刺激机体产生较高滴度特异性抗体.HZ可以作为预防和治疗幽门螺杆菌感染的候选口服疫苗株.
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TNF受体（P55）和IgG Fc的融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达
目的在真核细胞表达具有生物活性的可溶性肿瘤坏死因子（TNF）受体蛋白，用于中和TNF的毒性。方法 将TNFR（P55）的胞外区基因和人IgG Fc段基因通过18个碱基的凝血酶切点连接，克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋），在COS7和BHK细胞分别得到目的蛋白的表达。结果 在真核表达系统表达了TNFR（P55）胞外区与人IgG Fc段的融合蛋白，免疫学实验及L929细胞体外实验均表明该蛋白具有TNFR（P55）特异的抗原性、与TNF结合的活性以及抑制TNF的活性。结论 真核表达的融合蛋白产物具有可溶性TNF受体（P55）的生物学活性。
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幽门螺杆菌HspA-CtxB口服疫苗的研制及免疫原性研究
目的观察幽门螺杆菌融合蛋白质热休克蛋白A-霍乱毒素B(HspA-CtxB,HCT)经口服免疫在小鼠小肠内的吸收情况及免疫后机体产生的免疫应答. 方法用PCR方法扩增hspA和ctxB 2个目的基因片段,将它们分别克隆至pSK(+)质粒上,然后插入含T7启动子pET-22b(+)的表达载体中,构建含双基因的表达质粒pET-hct,转化E.coli BL21(DE3),经 IPTG诱导表达融合蛋白质HCT;融合蛋白质经镍离子柱纯化、复性后,与HspA重组蛋白质共同标记同位素125I,经小鼠灌胃实验观察其在小鼠小肠内的吸收情况;HCT和HspA分别给小鼠灌胃进行免疫,每周灌胃2次,共8次,末次免疫后3d起收集小鼠粪便,次日眶后静脉采集静脉血,分别对标本进行IgG和IgA检测. 结果经测序,HspA-CtxB(HCT)融合基因片段由726bp组成,为编码242个氨基酸残基的多肽.经SDS-PAGE和免疫印迹分析检测发现,融合基因表达的蛋白质相对分子质量(M)r约为30×103.标记同位素125I的HCT和HspA,经小鼠灌胃实验观察不同时间段的吸收情况,结果发现在10～15min时间段,HCT组出现吸收峰值,约为对照组的8倍以上(P＜0.001),且吸收峰值时间明显提前;将HCT口服免疫小鼠,检测小鼠血清和粪便中的特异性抗体水平.结果HCT组(A405),血清IgA,2.98±0.35,血清IgG, 4.38±0.56,粪IgA, 2.89±0.68;HspA组(A405),血清IgA, 0.38±0.15,血清IgG,0.45±0.16;粪IgA, 0.69±0.23;正常对照(A405),血清IgA, 0.06±0.02,血清IgG, 0.09±0.06;粪IgA, 0.12±0.03. 结论融合蛋白质HCT经口服后可以在小鼠小肠内迅速地被吸收,经口服免疫后可以刺激机体产生较高滴度的特异性抗体.HCT可以作为预防和治疗幽门螺杆菌感染的候选口服疫苗株.
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人C-型利钠肽-血清白蛋白融合蛋白质的构建及在毕赤酵母中的分泌表达
目的 构建重组表达人C-型利尿钠肽(CNP)-人血清白蛋白(HAS)融合蛋白质的毕赤酵母.方法 重叠PCR拼接CNP(400 bp)-HAS(1 800 bp)成融合基因,双酶切后克隆至表达载体pPIC9K中.电穿孔法转染毕赤酵母菌KM71,摇瓶培养分泌表达.结果 融合基因约为2 200 bp,序列测定正确.SDS-PAGE分析相对分子质量约为80 000,Western blot和RIA鉴定显示其为CNP与HAS的杂合分子.结论 实现了HAS-CNP融合蛋白质在毕赤酵母中的分泌表达.
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m4AChR-Gilα融合蛋白的建立、表达及几种配体对其机能的影响
目的通过Baculovirus-Sf9细胞系统制备并表达m4AChR-Gilα融合蛋白,检测几种配体对融合蛋白质中m4AChR与Gilα间相互作用,并以该融合蛋白质为工具,筛选m4AChR的特异性配体.方法两步聚合酶链反应建立m4AChR-Gilα融合cDNAs,并在Sf9细胞内表达.通过[3H]QNB和[35S]GTPγS替代结合实验研究几种配体乙酰胆碱、卡巴胆碱、AF-102B、prifinium、AF-DX116和阿托品对m4AChR-Gilα融合蛋白的作用.结果m4AChR-Gilα融合蛋白表达水平为(47.04±1.58)pmol/g蛋白,不同配体使融合蛋白质中Gilα与二磷酸鸟苷的亲和力发生变化.结论杆状病毒表达的m4AChR-Gilα融合蛋白具备m受体配体结合特性和组分间的偶联功能.配体通过改变融合蛋白质中Gilα与二磷酸鸟苷的亲和力,活化该融合蛋白质.
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幽门螺杆菌粘附素与大肠杆菌LtB融合疫苗的口服免疫与预防试验
目的观察幽门螺杆菌粘附素HpaA与大肠杆菌LtB融合蛋白质经口服免疫BALB/c小鼠后机体产生的免疫应答和蒙古沙鼠免疫预防作用.方法用PCR方法扩增HpaA和LtB目的基因片段,将LtB与pPIM质粒连接后,再与HpaA基因连接,转化大肠杆菌DH5α,经酶切获得含有ltB-hpaA的pPIM-ltB/hpaA融合质粒.将重组质粒转化E.coli BL21(DE3),筛选获得重组工程菌,经发酵、包涵体提取,复性,纯化获得LtB-HpaA.BABL/c小鼠设正常对照组、单独rHpaA对照组、CT+ HpaA实验组、融合蛋白LtB-HpaA组和rLtB+rHpaA实验组,免疫4周后检测血清抗原特异性IgG、IgA和胃冲洗液、肠冲洗液中sIgA.蒙古沙鼠分3个实验组,正常对照(PBS)组,单独HpaA免疫组和LtB-HpaA组,免疫4周,于末次免疫后14天灌活力良好的H.pylori SS1活菌,1个月处死动物,采集标本,用细菌培养和病理切片检查评价蒙古沙鼠的免疫保护作用.结果融合蛋白LtB-HpaA组及将CT和LtB作为外粘膜佐剂的CT+HpaA组和LtB+HpaA组中血清IgA和IgG、胃冲洗液和肠冲洗液中sIgA含量明显高于单独HpaA组和对照组,差异非常显著(P＜0.001).蒙古沙鼠融合蛋白rLtB-HpaA组比单纯rHpaA组效果明显(rLtB-HpaA组保护率为80%,单独rHpaA为20%).结论融合蛋白质LtB-HpaA经口服免疫后可以刺激机体产生较高滴度的特异性抗体并使蒙古沙鼠产生较好的预防保护作用.LtB-HpaA可以作为预防和治疗幽门螺杆菌感染的候选口服疫苗株.
