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双歧杆菌粘附素的提纯
双歧杆菌存在于人体肠道,对宿主发挥生物屏障、营养、免疫、控制内毒素血症、延缓衰老、抗肿瘤等生理作用,已广泛应用于益生菌制剂(Probiotics).由于双歧杆菌粘附于肠粘膜上皮细胞是其发挥作用的首要条件,开展对其粘附机制的研究有着重要意义.我们对双歧杆菌的粘附素进行分离纯化.
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尿路致病性大肠杆菌fimC和fimH基因诱导小鼠免疫应答的初步研究
尿路致病性大肠杆菌(UPEC)是引起尿路感染的主要病原菌.此类大肠杆菌80%携带Ⅰ型菌毛.现已证明UPEC的Ⅰ型菌毛的编码基因位于染色体上,由9个基因组成.其中fimH基因编码的蛋白--FimH粘附素,能与泌尿道上皮细胞表面甘露糖受体结合并可诱导细菌的细胞内在化.FimC蛋白是FimH蛋白的伴侣分子,在保持Ⅰ型菌毛的折叠和长度上起着关键的作用,可增强FimH蛋白的免疫原性[1].Langermann等制备FimH和FimC纯化蛋白混合疫苗,可以诱发动物产生抗Ⅰ型菌毛抗体,使猴对UPEC的感染有保护作用[2,3].
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130例妊娠妇女生殖道的生殖支原体检测
生殖支原体(Mycoplasma genitalium Mg)于1981年首次发现,其形态似烧瓶,靠末端的粘附素(pa蛋白)粘附于宿主细胞而致病.近10年来,实验室和临床方面研究已取得了很大进展,但其致病性方面的研究尚少.作者对130例妊娠妇女进行检测,旨在了解Mg在孕妇中的分布情况,寻找研究Mg的合适途径.
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幽门螺杆菌粘附素基因hpaA的克隆及序列分析
目的:对一株临床分离的高粘附力幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)菌株M1进行粘附素基因hpaA的序列分析,为研究Hp的粘附提供分子基础.方法:设计hpaA的特异引物,将PCR产物插入pUC19载体构建hpaA的重组克隆,DNA自动分析仪进行序列测定,Clustal X和Homology软件分析DNA及其推导出的氨基酸序列.结果:构建了粘附素HpaA的重组质粒pUC-hpa,测序显示hpaA结构基因长783 bp,开放读框完整,无中断,与文献报道的序列有差异;该基因编码261个氨基酸,其中一段氨基酸序列KRTIQK与大肠杆菌粘附素K99、SfaS、CFA/Ⅰ中的涎酸结合位点的结构相似.结论:Hp粘附素基因hpaA在不同菌株存在差异,但其粘附作用有相似的分子基础.
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claudin-7与E-cadherin在肝癌中的表达及相关性研究
肿瘤的侵袭和转移是重要的生物学行为,claudin一7属于claudins蛋白家族,是构成细胞紧密连接的重要成分,其异常表达与肿瘤的发展及预后相关.上皮粘附素(E-cadherin)是重要的粘附蛋白,在多种肿瘤的转移中起重要作用.我们于2006年1月至2009年12月用流式细胞术半定量检测claudin-7与E-cadherin在肝癌及正常肝组织中的表达,分析其表达意义及相互关系,为探讨肿瘤的生物学行为提供依据,报告如下.
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大肠埃希菌临床株Dr粘附素的检测及其序列分析
目的:研究Dr粘附素在大肠埃希菌临床株中的携带情况及其在Afa/Dr家族粘附素中所占的比例,并分析draE基因的突变情况.方法:采用PCR检测600株大肠埃希菌中Afa/Dr家族粘附素的共有序列afa/draC及Dr粘附素的特异序列draE,并对draE基因进行序列分析.结果:600株大肠埃希菌中,402株(67%)携带Afa/Dr家族粘附素,其中Afa/Dr家族粘附素阳性菌株中3株(0.75%)为Dr粘附素阳性菌株.draE序列分析显示,该基因片段与genebank中的相应序列对比有1~3个点突变.结论:国内大肠埃希菌临床株中存在Dr粘附素,其draE基因片段与genebank中标准draE基因序列AF329316具有高度同源性.
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淋巴细胞穿越血管内皮机制的研究进展
淋巴细胞和多形核细胞向血管外迁移是一个复杂的过程,其中涉及了大量的粘附分子,包括选择素、整合素、免疫球蛋白基因超家族、钙依赖性粘附素家族等,是目前研究的热点,白细胞的大量浸润在某些疾病的发生发展过程中起重要作用,明确其机理对于疾病的防治有重要意义。现将近几年有关粘附分子在淋巴细胞穿越内皮过程中的作用及机理的研究进展作一综述。
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幽门螺杆菌HpaA-CtxB融合蛋白的表达及其免疫原性研究
目的:探讨幽门螺杆菌融合蛋白粘附素-霍乱毒素B亚单位(HpaA-CtxB,HCTB)经口服免疫小鼠后,机体产生的免疫应答.方法:用PCR方法扩增HpaA和CtxB两个目的基因片段,将它们分别克隆至pET-32a(+)和pQE-30质粒上,然后同时插入pQE-30表达载体中,构建含双基因的的表达质粒pQE-HCTB,转化E.coli DH5α,经IPTG诱导表达融合蛋白HCTB;Western blot分析其免疫反应性.融合蛋白经镍离子柱纯化后,HCTB和HpaA分别给小鼠灌胃进行免疫, ELISPOT和ELISA分别检测小鼠胃粘膜、派伊尔小结(Peyer′s patches, PP)抗原特异性抗体分泌细胞(ASC),和血清IgG、IgA、小肠粘液sIgA和粪便sIgA.结果:经测序HCTB融合基因片段由1 161 bp组成,为编码387个氨基酸残基的多肽.经SDS-PAGE分析相对分子量(Mr)约为 40 000.可溶性表达占全菌的25%以上,经亲和层析后可获得纯度为92%以上的重组蛋白.Western blot分析其能分别与HpaA抗血清和CT抗血清特异性反应.灌胃免疫小鼠后ELISPOT和ELISA检测结果,胃和PP sIgA-ASC、IgG-ASC数量明显增加,尤以sIgA-ASC为甚,同时血清IgA、IgG,粪sIgA,肠粘液sIgA也明显高于HpaA组和对照组(P<0.05和P<0.01).结论:融合蛋白HCTB经口服免疫可有效诱导粘膜免疫应答,产生高水平的sIgA,发挥局部粘膜免疫作用.HCTB可作为集预防和治疗为一身的Hp候选口服疫苗.
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融合蛋白VacA-HpaA卵黄抗体的体外研究
目的:研究VacA-HpaA融合蛋白的鸡卵黄抗体(IgY)的理化特性和生物学活性,为制备集预防与治疗为一体的抗H.pylori感染的制剂奠定基础.方法:以纯化的VacA-HpaA融合蛋白免疫产蛋鸡,水稀释法获取蛋黄抗体(VacA-HpaA IgY).(1)用硫酸铵沉淀法纯化IgY后,用SDS-PAGE分析其纯度,Bradford法测定蛋白含量.(2)用间接ELISA法检测该IgY的耐热性、耐酸性及其对酶消化的耐受作用.(3)采用Western blot分析IgY的特异性并检测其效价.(4)用MTT法检测不同浓度VacA-HpaAIgY对细胞毒活性的中和作用.(5)用扫描电镜观察VacA-HpaA IgY对AGS细胞粘附的中和作用.结果:(1)该IgY 纯度为60%,蛋白浓度为22 g/L;(2)具有一定的耐热性、耐酸性和耐胃蛋白酶能力;(3)Western blot分析显示IgY的特异性,在相对分子量约27 000和30 000处出现在相应的条带;(4)该IgY对VacA细胞毒活性有中和作用,且具有量效性和时效性;(5)IgY可阻止H.pylori菌体蛋白的粘附作用.结论:该IgY具有良好的理化和生物学特性,可用于制备抗H.pylori感染的防治制剂.
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幽门螺杆菌粘附素hpa A和霍乱毒素B亚单位ctx B融合基因的原核表达
目的构建幽门螺杆菌粘附素(hpa A)和霍乱毒素B亚单位(ctx B)融合基因的原核表达载体,诱导表达并进行纯化.方法用PCR扩增hpa A和ctx B两个目的基因片段,克隆至同一pQE-30表达载体中,构建含双基因的表达质粒pQE-hct,转化E.coli DH5α,经IPTG诱导表达融合蛋白HCT;经Western blot分析其免疫原性,采用镍离子柱进行纯化.结果经测序HCT融合基因片段由1161 bp组成,为编码387个氨基酸残基的多肽.经SDS-PAGE分析相对分子质量约为40000.可溶性蛋白占菌体总蛋白的25%以上,经亲和层析后可获得纯度为92%以上的重组融合蛋白.经Western blot检测可被Hp全菌抗血清和CT抗血清识别.结论已成功构建融合蛋白HCT的原核表达载体并能高效表达,为研制Hp口服疫苗提供依据.
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泌尿道致病性大肠埃希菌PapG重组蛋白对小鼠尿道上行感染的免疫保护作用
目的探讨泌尿道致病性大肠埃希菌(UPEC)P菌毛粘附素PapG重组融合蛋白对小鼠尿道上行感染的免疫保护作用.方法纯化蛋白按一定程序免疫BALB/c雌性小鼠,末次免疫后第7天用UPEC临床分离株进行尿道上行攻击;攻击后第5天检测尿液和肾脏培养菌,同时测定血清抗体效价.结果经GST-PapG重组蛋白和GST纯化蛋白免疫的小鼠体内均产生了相应的抗体,而仅经重组蛋白免疫的小鼠具有一定的抵抗毒株上行感染的能力,表现为肾脏培养菌量均明显减少.结论 PapG粘附素与GST构成的重组融合蛋白对小鼠尿道上行感染具有一定的免疫保护作用.
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幽门螺杆菌粘附机制的研究进展
幽门螺杆茵粘附于胃黏膜是其进一步发挥致病作用的前提,本文从幽门螺杆菌的粘附素、粘附素相关受体、粘附于胃上皮细胞的病理机制以及粘附素在该茵疫苗构建中的作用对其粘附机制的研究进展作一综述。
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043 毒力基因stx1、stx2、eae、ehxA和自凝粘附素的多重聚合酶链反应法直接检测和鉴定产志贺毒素大肠埃希菌
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幽门螺杆菌粘附素AlpA基因克隆、表达及免疫原性研究
目的构建表达幽门螺杆菌(Hp)黏附素AlpA的候选菌株并研究其免疫原性.方法利用PCR技术扩增粘附素AlpA基因,将其定向插入pET-22b(+)载体,在BL21(DE3)大肠杆菌中表达并通过免疫印迹实验研究其免疫原性.结果克隆的粘附素AlpA基因序列与基因库公布的基本一致,粘附素AlpA重组蛋白表达量占菌体总蛋白的31.9%,经免疫印迹证实该重组蛋白可被AlpA免疫兔血清和Hp感染患者血清所识别.结论AlpA克隆、高效表达及其免疫原性的初步证实,为Hp基因工程疫苗的研制和粘附机制的研究打下了基础.
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双歧杆菌纯化粘附素对艰难梭菌粘附肠上皮细胞的竞争抑制作用
艰难梭菌对肠上皮细胞的粘附是其定植和感染的前提.以往的研究多集中于肠道正常菌群如双歧杆菌拮抗肠道致病菌粘附肠上皮细胞的研究[1,2],但由于活菌的制造和保存难度较大而使其应用受到一定程度的限制.
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幽门螺杆菌粘附素及其致病性
幽门螺杆菌粘附于胃粘膜是其致病的首要步骤,粘附素是其粘附定居的物质基础,本文就幽门螺杆菌粘附素及其致病性,以及粘附素在幽门螺杆菌疫苗研究中的应用作了综述.
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肺炎支原体的粘附分子与肺炎支原体感染
肺炎支原体(Mycoplasma pneumomae,MP)引起的肺炎支原体肺炎(Myciplasmalpneumomae pneumoma,MPP)占各类肺炎总数的10~30%,好发于5~15岁的儿童和青少年,全年均可发病以秋冬季多见.其基本病理变化是一种化脓性细支气管炎和间质性肺炎.一般认为MPP的发病机制与以下三方面的因素有关:MP的粘附;上皮细胞的毒性变化;机体免疫调节机制的异常[1].在这三个因素中MP粘附分子的作用贯穿始终.首先是MP借助其粘附分子(亦称粘附素)吸附于呼吸道上皮细胞完成感染定殖的第一步;而后才能引起上皮细胞的各种毒性改变;同时,这些粘附分子还是MP重要的免疫原可以诱导机体产生强烈的免疫应答,导致免疫调节机制的异常,终引起机体肺部和肺外多系统的病变.近年来国内外学者对MP粘附分子作了深入的研究,主要体现在以下几个方面.
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霍乱弧菌2个染色体的DNA序列
John F.Heideberg等以全基因组随机测序法测定了革兰氏阴性的γ-蛋白细菌埃尔托霍乱弧菌N16961的基因序列,其完整基因组序列有4 033 460个碱基对.该基因组包括2个大小不同的环状染色体(大染色体和小染色体),分别有2 961 146和1 072 314个碱基对,这些碱基对共同编码3 885个开放读框(见表1).大多数细胞功能所必需的(如DNA复制、转录、翻译和细胞壁生物合成)和致病性(如毒素、表面抗原和粘附素)基因位于大染色体上.但小染色体包含的假定基因(59%)比大染色体(42%)多,同时也含有更多的起源基因,这与γ-蛋白细菌不同.小染色体还携带有一个基因捕获系统(整合子岛)和通常只在质粒上发现的"嗜"宿主基因,小染色体原来可能是个由弧菌祖先捕获的大质粒.
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幽门螺杆菌融合蛋白HCTV的表达及免疫原性研究
目的构建表达幽门螺杆菌融合蛋白粘附素-细胞空泡毒素A-霍乱毒素B亚单位(HpaA-CtxB-VacA,HCTV)的原核表达载体,并诱导表达,为制备具有治疗与预防作用的多联疫苗奠定基础.方法用PCR技术从pQE-hctB扩增hpaA和ctxB目的基因片段,从pQE30-V质粒扩增出vacA基因,同时插入表达载体pQE-30,构建成pQE-hctv.再将pQE-hctv转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导表达.SDS-PAGE分析表达结果.Western blotting鉴定其抗原性.结果融合蛋白的相对分子量约为68000,可溶性表达占全菌的15%以上,经亲和层析后可获得纯度为90%以上的重组蛋白.Western blotting分析其能分别与HpaA抗血清、VacA抗血清和CT抗血清特异性反应.结论重组表达质粒pQE30-hctv表达成功,而且具有各自蛋白的抗原性,为进一步研究融和蛋白的功能和制备集预防和治疗为一体的Hp候选口服疫苗提供基础.
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幽门螺杆菌粘附素与大肠杆菌LtB融合疫苗的口服免疫与预防试验
目的观察幽门螺杆菌粘附素HpaA与大肠杆菌LtB融合蛋白质经口服免疫BALB/c小鼠后机体产生的免疫应答和蒙古沙鼠免疫预防作用.方法用PCR方法扩增HpaA和LtB目的基因片段,将LtB与pPIM质粒连接后,再与HpaA基因连接,转化大肠杆菌DH5α,经酶切获得含有ltB-hpaA的pPIM-ltB/hpaA融合质粒.将重组质粒转化E.coli BL21(DE3),筛选获得重组工程菌,经发酵、包涵体提取,复性,纯化获得LtB-HpaA.BABL/c小鼠设正常对照组、单独rHpaA对照组、CT+ HpaA实验组、融合蛋白LtB-HpaA组和rLtB+rHpaA实验组,免疫4周后检测血清抗原特异性IgG、IgA和胃冲洗液、肠冲洗液中sIgA.蒙古沙鼠分3个实验组,正常对照(PBS)组,单独HpaA免疫组和LtB-HpaA组,免疫4周,于末次免疫后14天灌活力良好的H.pylori SS1活菌,1个月处死动物,采集标本,用细菌培养和病理切片检查评价蒙古沙鼠的免疫保护作用.结果融合蛋白LtB-HpaA组及将CT和LtB作为外粘膜佐剂的CT+HpaA组和LtB+HpaA组中血清IgA和IgG、胃冲洗液和肠冲洗液中sIgA含量明显高于单独HpaA组和对照组,差异非常显著(P<0.001).蒙古沙鼠融合蛋白rLtB-HpaA组比单纯rHpaA组效果明显(rLtB-HpaA组保护率为80%,单独rHpaA为20%).结论融合蛋白质LtB-HpaA经口服免疫后可以刺激机体产生较高滴度的特异性抗体并使蒙古沙鼠产生较好的预防保护作用.LtB-HpaA可以作为预防和治疗幽门螺杆菌感染的候选口服疫苗株.