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  • 临床分离艰难梭菌毒素携带特征研究

    作者:程颖;卢金星;鄢盛恺;贾红兵;李文革

    目的 对医院细菌室送检粪便标本中分离出的艰难梭菌,进行毒素基因以及耐药基因的初步分析.方法 将细菌室收集到的112份粪便标本,经选择性厌氧培养,谷氨酸脱氢酶(GDH)以及API 20A生化条鉴定后,分离出12株艰难梭菌,分别采用PCR的方法检测tcdA和tcdB基因、二元毒素基因,克林霉素抗性基因(ermB).结果 12株艰难梭菌中8株为毒素基因阳性,其中tcdA+tcdB+为5株,占62.5%;tcdA-tcdB+为3株,占37.5%;二元毒素基因均为阴性;耐药基因ermB阳性为4株,占50%.结论 艰难梭菌tcdA-tcdB+毒株所占比例增加,临床单独检测A毒素易造成漏检;艰难梭菌耐药现象值得关注.

  • 医院分离艰难梭菌耐药性研究

    作者:程颖;卢金星;鄢盛恺;贾红兵;李文革

    目的 通过对临床分离的8株产毒型艰难梭菌进行PCR分型以及抗生素敏感性分析,初步了解临床分离艰难梭菌的耐药情况,为临床用药提供参考依据.方法 临床送检的粪便标本,经生化鉴定和毒素检测后,确定8株为产毒型艰难梭菌,分别采用PCR方法进行分型,并采用Etest方法测定8株艰难梭菌对氨比西林(AC)、克林霉素(CM)、甲硝唑(MZ)、万古霉素(VA)的小抑菌浓度,并对耐药性进行初步分析.结果 8株产毒型艰难梭菌中有5株属于同一型别,7株出现耐药;3株对AC耐药;7株对CM耐药;1株对MZ耐药;未检测到对VA耐药菌株.结论 临床分离艰难梭菌耐药比例高,且存在多重耐药;临床应加强艰难梭菌及厌氧菌抗生素敏感性检测.

  • 艰难梭菌分子分型技术研究进展

    作者:黄忱;罗芸;王贤军;金大智

    艰难梭菌是一种革兰阳性的专性厌氧产芽孢杆菌.核糖体027型高毒力株在发达国家的多次暴发使得艰难梭菌越来越引起重视,近年来艰难梭菌感染的发生频率已在全世界范围内呈显著上升趋势.目前该菌的分子流行病学研究进展较快,常用的分子分型方法包括限制性酶切分型、PCR核糖体分型、脉冲场凝胶电泳、多位点序列分析、重复序列PCR分型、多位点可变数目串联重复序列分析、毒素分型和全基因组测序分析等.同时,仍有不断改进的新型分子分型方法应用于此,以期更准确、快速和有效地对艰难梭菌感染暴发进行识别与调查,为艰难梭菌的感染防控提供可靠的分子流行病学数据.

  • 咔哒唑胺与利奈唑胺对艰难梭菌的敏感性实验

    作者:刘笑舒;廖凤;于栓宝;李文革;陈小萍;吴媛;卢金星

    目的 比较咔哒唑胺与利奈唑胺对不同基因和毒素型别的艰难梭菌的抑菌效果,以及咔哒唑胺对艰难梭菌芽孢形成的影响.方法 采用咔哒唑胺与利奈唑胺对10株不同基因型别的艰难梭菌、1株产气荚膜梭菌和1株脆弱拟杆菌进行药物敏感性实验,获得各菌株测试药物对应的低抑菌浓度(MIC)值.选取其中1株艰难梭菌ATCC BAA-1803,核糖体027型高毒株,试验咔哒唑胺对菌株芽孢形成的影响,从而对药物进行评价.结果 艰难梭菌咔哒唑胺MIC为0.25 μg/ml(0.03 ~0.25 μg/ml),利奈唑胺MIC为4.0μg/ml(0.5~ 16.0 μg/ml),艰难梭菌咔哒唑胺MIC值低于利奈唑胺16倍.2种抗生素对不同基因型别与毒素型别的艰难梭菌均具有良好抑菌效果,同时对产气荚膜梭菌也具有抑菌效果.咔哒唑胺对脆弱拟杆菌不产生抑菌效果,利奈唑胺对其有抑菌效果.咔哒唑胺能抑制艰难梭菌芽孢形成.结论 临床常见的不同基因型和毒素型别的艰难梭菌对咔哒唑胺敏感,咔哒唑胺可用于治疗艰难梭菌感染.

  • 艰难梭菌五种实验室检测方法的评价

    作者:刘笑舒;廖凤;李文革;古文鹏;张文竹;陈小萍;吴媛;卢金星

    目的 比较5种艰难梭菌检测方法并进行评价.方法 包括tcdB基因PCR检测、tcdB基因Real-time PCR检测、酶联免疫法、酶联免疫层析法以及环丝氨酸-头孢西丁-果糖琼脂(CCFA)常规培养法.以CCFA培养的检测结果作为参考,对以上几种方法进行评价.结果 得到上述检测方法的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值结果以及其与参考方法的Kappa值.在125例样本中,CCFA培养法检出阳性标本11份,tcdB基因普通PCR检测、tcdB基因Real-time PCR检测、酶联免疫法、酶联免疫层析法分别检出阳性12、12、50和25例,4种方法间检出阳性率差异有统计学意义(x2=61.452,P <0.000 1),敏感度分别为63.64%、63.64%、63.64%和54.55%,差异无统计学意义(x2=0.288,P=0.962);特异度为95.61%、95.61%、62.28%和83.33%,差异有统计学意义(x2=63.597,P<0.000 1).结论 PCR方法敏感度、特异度高,成本较低,适用于有实验条件的流行病学调查和临床诊断,两种免疫方法试剂盒适用于临床先期筛查以及辅助诊断.

  • 艰难梭菌污染现状

    作者:吴琳;汤建平;邵景东;博春玲

    艰难梭菌是引起人类腹泻的致病菌,艰难梭菌相关性腹泻(CDAD)的发生率在世界各地呈上升趋势.与此同时艰难梭菌在动物粪便及食物中检出率的报道也不断上升,通过食物传播艰难梭菌被认为是引起CDAD的可能途径,但目前尚不清楚艰难梭菌是否为食源性病原体.本文综述了艰难梭菌在水、动物和食物中的检出污染现状及致病菌株的分布.

  • 24小时培养法与PCR扩增tcd B基因法鉴定艰难梭菌的比较

    作者:洪亚华

    目的 分析比较24 h培养法与PCR扩增tcd B基因法鉴定艰难梭菌的效果.方法 随机选取2013年1月至2015年1月南安市医院收治住院患者,抽取其中50例的腹泻粪便标本,均分离出艰难梭菌,同时根据检测方法的不同将其分为研究组(25例)、对照组(25例).对照组采用24 h培养法进行鉴定检测,研究组采用PCR扩增tcd B基因法鉴定,比较两组临床艰难梭菌鉴定结果.结果 研究组中,临床经PCR扩增tcd B基因法鉴定后,明显提升临床鉴定艰难梭菌的阳性率,与对照组比较存在统计学意义(P<0.05).结论 应用PCR扩增tcd B基因法鉴定,效果优于24h培养法鉴定,可将PCR扩增tcd B基因法作为临床艰难梭菌鉴定的重要方法.

  • 海宁市106例腹泻病例艰难梭菌感染监测与分析

    作者:周惠芳;顾蓓青;蒋逸群;王洁

    目的:对海宁市住院和门诊病人艰难梭菌感染情况进行分析,并对菌株进行分子特征和流行病学的初步分析.方法:将2016年7月1日-2017年1月31日收集到的106份粪便标本,其中住院病人72份,门诊病人34份,经选择性厌氧培养分离,采用实时荧光定量PCR的方法检测tcdA和tcdB基因,并对菌株进行MLST分型.同时对临床资料进行分析.结果:106份标本中共检测出产毒型艰难梭菌17株(16.0%),其中12株为毒素基因A和B均为阳性(70.6%),5株仅毒素基因B阳性(29.4%).共检测出7种ST型,其中ST37型占比高(29.4%).住院超过3天以上的病人阳性率为20.83%(15/72),门诊病人阳性率为5.88% (2/34)(x2=50.256,P<0.001).住院病人中(门诊病人无发热和血常规数据),阳性患者中发热(舌下温度大于37.2℃)的为9人(9/15,60.0%),与阴性患者相比,差异有统计学意义(x2 =4.687,P=0.030);血常规白细胞数量偏高(大于10×109/L)的为10人(10/15,66.7%),与阴性患者相比,差异有统计学意义(x2 =4.872,P=0.027).结论:海宁市临床住院患者中存在一定比例的艰难梭菌感染,除了毒素基因tcdA/B阳性菌株外,ST37基因型占有比例较高,可能是潜在的流行株.

  • 5种手卫生方法对艰难梭菌清除效果比较

    作者:郭凤玲;温世宝;胡旻;张小倩

    目的 比较5种手卫生方法对医务人员手上艰难梭菌的去除效果.方法 采用棉拭涂抹采样和细菌定量检测方法,对5种不同手卫生方法清除人工污染在医务人员手上艰难梭菌的效果进行比较观察.结果 分别用普通肥皂液、抗菌肥皂液、流动水、含醇快速手消毒液六步洗手操作法和季铵盐消毒湿巾擦拭法进行手卫生处理,对人工污染在医务人员手上的艰难梭菌清除对数值依次为2.73、2.64、1.01、0.25和2.13.结论 5种手卫生方法中,以两种皂液洗手法对手上艰难梭菌清除效果好,消毒湿巾法次之.

  • 艰难梭菌分子分型技术及其应用

    作者:严其容;程颖;卢金星

    艰难梭菌是一种专性厌氧的革兰阳性杆菌,能够产生肠毒素A和细胞毒素B,是导致假膜性结肠炎的主要致病菌,并能引起牛、猪等动物腹泻.2001年以来,艰难梭菌感染在欧美各国广泛流行,住院患者感染率在英国占15.0%、法国1.7%~6.4%、西班牙8.8%、加拿大17.0%、印度15.0%;在中国,由于开展厌氧菌培养鉴定的实验室很少,尚无确切的统计数据.

    关键词: 艰难梭菌 分子分型
  • 参苓白术散对体外艰难梭菌生长的影响

    作者:舒青龙;徐刚;叶荷平;章喜林;封勇;魏娜

    目的:探讨参苓白术散对抗生素相关性腹泻(AAD)主要致病菌艰难梭菌的体外抑菌作用.方法:按正常培养组(脑心浸液培养基培养)和加药培养组(脑心浸液培养基中加入不同稀释梯度的参苓白术散水煎剂,加药体积分别为体积比为:10-1,10-2,10-3,10-4),应用连续采样和分光光度法,测定4株艰难梭菌((NC-1,NC-2,SH182,和SH186,其中2株为A+B+,2株为A-B+)的体外生长曲线.结果:加药(参苓白术散水煎剂)体积比为:10-1,10-2,10-3,10-4的培养基对艰难梭菌NC-1,以及加药体各为10-1的参苓白术散水煎剂对艰难梭菌NC-2有明显的抑制作用(P<0.05),不同稀释度的加药培养基对4种不同的艰难梭菌均有一定的影响,艰难梭菌大生长细菌菌落均有一定程度的减少.结论:参苓白术散对AAD病主要致病菌艰难梭菌在体外具一定的抑制作用.

  • 艰难梭菌细胞毒素B功能区的原核表达及免疫原性

    作者:刘红升;张清华;蒋知新;姜泊

    目的 纯化已表达艰难梭菌(CD)细胞毒素B羧基末端受体结合区(CD3)的基因,并检测其免疫原性.方法 PCR克隆目的基因到表达载体pET22b(+),重组质粒转化到E. coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,利用金属螯合色谱层析方法纯化后,SDS-PAGE方法对纯化蛋白进行分析.并检测其免疫反应性.结果 成功表达的是分子质量约为71.3 ku的重组蛋白,占菌体总蛋白的34%,可溶性表达占上清的22.7%,包涵体占沉淀的25.7%.重组蛋白纯化后可溶性蛋白浓度为0.781 g/L.并与抗毒素B抗体具有良好的免疫原性.结论 成功克隆了CD3基因,构建的重组质粒可高效表达CD3重组蛋白,为CD相关性疾病的诊断及后期制备疫苗,提供了有力的保障.

  • 艰难梭菌新型氧化还原酶Fnr的异源表达与纯化

    作者:王媛媛;梁继禹;于文君;许晓群;王书宁;黄海燕

    目的 了解艰难梭菌新型氧化还原酶Fnr的性质和催化功能. 方法 通过PCR扩增艰难梭菌的fnr基因片段,利用限制性内切酶NheⅠ、XhoⅠ对PCR产物进行双酶切,酶切片段插入经相同酶切处理的pET28b(+)质粒中,构建pET28b(+)-fnr重组表达载体,测序验证正确后转化至E.coli C41 (DE3)感受态细胞中,用IPTG诱导表达目的蛋白,Ni-NTA柱亲和层析纯化后进行纯度及酶活性测定. 结果 成功构建了pET28b(+)-fnr重组表达载体,转化E.coli C41 (DE3)高效表达重组蛋白Fnr.柱层析纯化后进行SDS-PAGE分析,该蛋白由两个大小分别约为51×103和33×103的亚基组成,具有NAD+依赖的NADPH还原TTC的活性.其酶所展现的性质一致,表明它们具有相同的生化功能. 结论 成功表达和纯化了艰难梭菌Fnr重组蛋白,该蛋白具有与其他专性厌氧菌对应的氧化还原酶活性,为其生理功能奠定研究了基础.

  • 艰难梭菌A毒素致细胞圆缩化和致死活性的相关性研究

    作者:马雪瑛;郑荣梁;孟筱琦

    艰难梭菌(Clostridium difficile)是人假膜性结肠炎和抗生素相关性腹泻的主要致病因子.其产生A、B两种与疾病有关蛋白毒素,其中由于A毒素具有肠道毒性而被认为是引起疾病的主要致病因子[1].A毒素的相对分子质量(Mr)很大,在未变性的状态下为(520~540)×103,在变性状态下降解为(220~240)×103左右,没有亚基分离.A毒素有肠道毒性、细胞毒性、小鼠致死活性、血球凝集活性、血管通透亢进等生物学活性.A毒素是一种可溶性蛋白,它通过受体介导的内吞作用进入细胞,诱导许多种哺乳动物组织和细胞发生细胞病变效应[1,2].A毒素对细胞的影响非常复杂,对A毒素的细胞毒性研究一般都是以细胞骨架变化引起的细胞形态变化即细胞圆缩化为敏感指标的,但是有报道认为细胞圆缩化后并不一定死亡[3].而国内虽然对艰难梭菌的分离、毒素精制、诊断方法及试剂方面有所研究,但还未对A毒素的细胞毒性展开工作.为此,我们采用非洲绿猴肾细胞Vero、人甲状腺乳头癌细胞TPC-1、人喉癌细胞HEP2、人肺癌细胞A549、人结肠癌细胞SW1116、人肝癌细胞SMMC7721等6种细胞系,探讨了在A毒素致细胞圆缩化和细胞致死活性之间的关系.

  • 艰难梭菌A毒素对人甲状腺乳头癌细胞系的毒性作用研究

    作者:马雪瑛;郑荣梁;孟筱琦

    艰难梭菌(Clostridium difficile)A毒素是艰难梭菌引起疾病的主要致病因子,具有肠道毒性、细胞毒性、小鼠致死活性、促血球凝集活性、致血管通透性亢进等生物学活性[1,2].艰难梭菌A毒素对组织和细胞有毒性作用,但其作用机制未完全阐明.目前国内对艰难梭菌A毒素的细胞毒性的研究刚刚起步,我们曾研究过艰难梭菌A毒素对HEP2等6种细胞的毒性作用,其中人甲状腺乳头癌细胞(TPC-1)对A毒素的敏感性较高[3].我们进一步观察A毒素对TPC-1细胞生长、细胞膜损伤、细胞形态和生化特征等方面的影响.

  • 异基因造血干细胞移植后艰难梭菌感染研究新进展

    作者:赵子君;涂三芳;黄鑫;李玉华

    异基因造血干细胞移植( allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,ALLO-HSCT)技术可治愈多种恶性及非恶性血液病。随着造血干细胞移植技术的不断发展和骨髓库的扩大,移植患者长期生存率不断提高。由于ALLO-HSCT术后患者机体免疫功能尚未完全重建及免疫抑制剂的长期使用,患者易发生细菌、病毒和真菌等的感染。细菌感染中以艰难梭菌的感染( Clostridium difficile infection,CDI)较为多见。目前,对移植后患者发生艰难梭菌感染的研究和认识并不全面。本文回顾近几年的研究,并主要对CDI的临床症状、诊断方法、危险因素及治疗方案进行分析探讨,以加深人们对艰难梭菌感染的认识,利于及早识别和确诊,以免病情加重和延误。

  • 艰难梭菌分离株快速鉴定和毒素检测的多重PCR方法的建立

    作者:贾红兵;王靖;杨辉;程颖;卢金星;鄢盛恺

    目的 建立可同时进行艰难梭菌分离株菌种鉴定和毒素检测的多重PCR方法。方法 用于多重PCR中的3对引物分别为艰难梭菌的种特异性的磷酸内糖异构酶(triose phosphate isomerase,tpi)基因、毒素A基因部分序列、毒素B基因部分序列。艰难梭菌ATCC 9689等21株标准菌株和47株临床分离艰难梭菌分别被应用于多重PCR低检出限、特异性评估试验和验证试验。同时,应用ELISA对47株分离株进行毒素A/B检测。结果 该多重PCR方法可检测到低DNA浓度为0.5 pg/μ l,特异性为100%。47株艰难梭菌分离株中tpi基因均为阳性,其中毒素基因A(+)/B(+)为37株,毒素基因A(-)/B(-)为10株,未检出毒素基因A(-)/B(+)菌株。47株毒素A/B检测结果为20株阳性、27株阴性。毒素A/B阳性的20株菌均为多重PCR检测毒素基因A(+)/B(+)。结论 成功建立用于艰难梭菌的菌种鉴定和毒素分析结合为一体的多重PCR方法,对临床诊断艰难梭菌感染有着重要应用价值。

  • 艰难梭菌临床分离株的毒素检测和MLST分型

    作者:贾红兵;杨辉;杜鹏程;魏利龙;曹沁梅;陈晨;程颖;王靖

    目的 初步研究中日友好医院艰难梭菌临床分离株的毒素特征、核糖体分型和多位点序列分型情况,为进一步监测医院内艰难梭菌暴发流行奠定基础.方法 收集2012年至2013年本院疑似艰难梭菌感染(Clostridium difficile infection,CDI)的321例腹泻患者的标本,采用表型培养法进行菌株分离和鉴定,并对分离菌株进行毒素B的细胞毒试验,分析菌株的毒素基因(tcdA、tcdB、cdtA、cdtB),采用核糖体分型(ribotyping, RT)和多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)分析菌株间的同源性;收集患者临床信息,分析不同患者人群的CDI发生率.结果 共从46名腹泻患者中分离到48株艰难梭菌菌株,其中3株菌株分离自同一患者;CDI发生率为14.3%(46/321),其中门诊患者为12.8%(5/39)、住院患者为14.5%(41/282);所有菌株的毒素B细胞毒试验均为阳性,其中ST1型较其他ST型菌株毒素作用更强;毒素基因tcdA(-)/tcdB(+)型为20.8%(10/48),主要是ST37和ST81;所有菌株的RT和MLST结果一致,均为相同的9个型别,其中以ST1/RT027为主,占27.1%(13/48),这些ST1/RT027菌株毒素基因检测均为tcdA(+)/tcdB(+)、二元毒素基因检测均为cdtA(+)/cdtB(+),其中中医呼吸病区占84.6%(11/13),提示该病区存在ST1/RT027型菌株的小范围暴发流行的可能.结论 CDI在我院主要以医院感染为主,分离株主要为毒素基因tcdA(+)/tcdB(+)的菌株,监测ST1/RT027高产毒性流行株引发的暴发流行尤为重要.

  • 利奈唑胺,莫西沙星及万古霉素治疗艰难梭菌相关性腹泻患者的临床疗效比较

    作者:祝莉娜

    目的:观察和比较利奈唑胺,莫西沙星及万古霉素治疗艰难梭菌相关性腹泻患者的临床疗效及安全性.方法:将180例艰难梭菌相关性腹泻的住院患者分为观察组A、观察组B和对照组,每组各60例.观察组A患者给予利奈唑胺治疗;观察组B患者给予万古霉素治疗;对照组患者给予莫西沙星治疗.对3组患者的的临床疗效、细菌清除率和不良反应进行临床对比分析.结果:与对照组相比较,观察组A和观察组B患者的细菌清除率明显改善,差异有统计学意义(P<0.05);不良反应无统计学差异(P>0.05).结论:利奈唑胺和万古霉素治疗艰难梭菌相关性腹泻患者的效果及细菌清除率基本相当,均优于莫西沙星.3组患者的不良反应发生率低,均安全可靠,值得临床研究和推广.

  • 艰难梭菌感染对结直肠癌患者营养及代谢的影响

    作者:童舟;罗芸;刘璐璐;郑怡;蒋微琴;陈晓刚;赵鹏;金大智;方维佳

    目的:探究艰难梭菌感染对结直肠癌患者营养及代谢的影响。方法留取205例肠癌患者术前粪便样本,根据有无艰难梭菌感染分成感染组(33例)及未感染组(172例),并在肿瘤浸润深度(T1、T2、T3、T4)、淋巴转移个数(N0、N1、N2)、隐血试验等因素下,检测两组患者的白蛋白、总蛋白水平。同时,比较两组患者在是否超重(体质量指数≥24)及不同性别下的游离脂肪酸水平,并根据患者年龄是否≥60岁进一步分组比较游离脂肪酸水平。结果感染组T4患者的白蛋白[(38±3)g/L vs.(41±5)g/L,t=2.211,P<0.05]和总蛋白[(63±7)g/L vs.(68±6)g/L,t=2.424,P<0.05]均较未感染组显著降低。且感染组隐血试验阳性患者的白蛋白[(38±5)g/L vs.(42±4)g/L,t=2.904,P<0.05]和总蛋白[(64±8)g/L vs.(68±6)g/L,t=2.537,P<0.05]水平较未感染组亦显著降低。而感染组N2患者中仅总蛋白较未感染组显著降低[(64±5)g/L vs.(69±6)g/L,t=2.085,P<0.05]。感染组超重[(0.25±0.12)mmol/L vs.(0.38±0.21)mmol/L,t=3.191,P<0.05]及男性患者[(0.26±0.12)mmol/L vs.(0.37±0.20)mmol/L,t=3.239,P<0.05]的游离脂肪酸水平较未感染组显著下降,且年龄≥60岁的超重[(0.24±0.13)mmol/L vs.(0.38±0.22)mmol/L,t=2.143,P<0.05]及男性[(0.23±0.12)mmol/L vs.(0.37±0.21)mmol/L,t=3.392,P<0.05]感染者较未感染者的游离脂肪酸水平更低。结论艰难梭菌感染的T4及隐血试验阳性的结直肠癌患者易引起白蛋白、总蛋白下降;超重、男性的老年感染患者更易出现脂肪代谢紊乱。

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