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IgY-和IgG-ELISA用于日本血吸虫病循环抗原检测的效果比较
目前，血吸虫病循环抗原的检测敏感度和特异度均不理想，交叉反应有待解决[1]。免疫检测体系中，探针的特异度和亲和力是影响检测效果的主要因素。IgY是卵黄免疫球蛋白的简称，是用特异性抗原免疫产蛋母鸡后母鸡血液中的抗体转移到蛋黄中去的，且是蛋黄中惟一存在的抗体，和哺乳动物的IgG相比，IgY具有高特异、高灵敏度，保存方便及稳定，且产量高，容易生产制备等优点。本研究综合利用IgY和单克隆抗体NP28-5B的双重优点，使用两种不同的ELISA体系进行比较，寻找提高敏感度和特异度并降低交叉反应的ELISA体系，为日本血吸虫病现场大规模筛查提供可靠的依据。
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抗日本血吸虫SEA特异性IgY应用于循环抗原检测的研究
本研究应用抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)的鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)建立敏感、特异的检测循环抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附试验( ELISA).用SEA皮下多点注射法免疫海蓝鸡,水稀释法制备IgY抗体,以辣根过氧化物酶标记纯化的IgY抗体(IgY-E)和兔抗IgG抗体(IgG-E)分别作为检测抗体,IgY抗体和兔抗IgG抗体分别作为捕捉抗体,组合建立4种双抗体夹心酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测循环抗原,分析各种方法检测SEA的灵敏度,并平行检测急性日本血吸虫病人血清6份、慢性日本血吸虫病人血清29份、华支睾阳性者血清9份、卫氏并殖吸虫阳性者血清15份、弓形虫阳性病人血清7份、正常体检者血清118份.结果显示,以IgY为捕捉抗体或检测抗体,可检测到浓度为7.5 ng/mL的SEA,灵敏度是基于IgG的夹心ELISA的4倍.4种夹心ELISA法检测急血病人血清阳性率均为100％,检测正常人血清的特异性为99.1％；与弓形虫、华支睾吸虫阳性者血清无交叉反应；而检测慢血病人血清和并殖吸虫阳性者血清时,以IgY为捕捉抗体的2种ELISA( IgY+ IgY-E、IgY+ IgG-E)阳性率均分别为79.3％、6.7％；而IgG为捕捉抗体时,以IgY为检测抗体(IgG+ IgY-E)时的阳性率分别为75.8％、6.7％,以IgG为检测抗体( IgG+ IgG-E)时的阳性率分别为72.4％、13.3％,以IgY作为捕捉抗体的检测效果优于IgG.基于IgY抗体的双抗体夹心ELISA检测循环抗原具有良好的敏感性和特异性,可用于日本血吸虫病的免疫诊断.
关键词： IgY 日本血吸虫 循环抗原 双抗体夹心ELISA -
双抗体夹心ELISA检测旋毛虫循环抗原实验条件的研究
目的 建立检测旋毛虫循环抗原(circulating antigens,CAg)的双抗体夹心ELISA方法.方法 以抗旋毛虫肌幼虫排泄-分泌(excretory-secretory,ES)抗原的鸡卵黄抗体IgY作为包被抗体,以抗ES抗原的小鼠单抗IgM作为检测抗体,建立监测旋毛虫CAg的双抗体夹心ELISA方法；应用棋盘滴定法,选择包被抗体、待测血清、检测抗体及酶结合物的佳稀释度,并测定方法的敏感性.结果 双抗体夹心ELISA检测旋毛虫CAg的佳条件为:IgY包被浓度为7.5 μg/ml,血清稀释度为1∶60,单抗稀释度为1∶2000,辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgM抗体稀释度为1∶2000.该方法检测旋毛虫CAg的敏感性为1 ng/ml.结论 建立的旋毛虫CAg双抗体夹心ELISA法具有较高的敏感性,有望用于旋毛虫病的早期诊断.
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产气荚膜梭菌α毒素突变体构建及其卵黄抗体制备
目的 制备特异性的产气荚膜梭菌α毒素(Clostridium perfringens alpha-toxin,CPA)卵黄抗体(yolk immunoglobulin,IgY).方法 利用定点突变技术,将CPA第56位天冬氨酸和第68位组氨酸分别突变为丝氨酸,构建了重组表达载体pTIG-mCPAD56S和pTIG-mCPAH68S,将其转化入E.coli Origami中进行诱导表达.用亲和层析的方法对突变体蛋白进行纯化并对其活性及抗原性进行检测,将获得的突变体蛋白分别免疫健康母鸡,收集鸡蛋;经水稀释法纯化卵黄中IgY;用酶联免疫吸附试验检测IgY效价;通过筛选保护剂而选择佳的IgY冻干条件.结果 与结论 pTIG-mCPA在Origami表达菌株中得到高效表达,经验证,mCPAD56S和mCPAH68S均完全失去生物学活性同时保留抗原性;纯化卵黄后得到较高纯度的特异性IgY,其效价可达到1∶200 000;经过IgY冻干条件的筛选,终选择不添加保护剂大量冻干IgY作为抗体的储备.该研究为研制基于IgY抗体的检测方法奠定了基础.
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关键词：
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鸡卵黄抗体的研究及在兽医学上的应用
随着实验室和临床研究对抗体需求的增加,廉价大规模抗体制备技术已成为新的研究课题.利用超免疫鸡将特异性抗体稳定持续地传至卵黄中,制备特异性多克隆抗体,成本低且产量高,有望成为规模制备特异性抗体的有效手段.1893年Klemperer首次报道鸡蛋中存在抗体[1].然而长期以来,这一发现并没有得到科学应用.
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鹭科和鸬鹚科卵黄抗体的纯化
目的 纯化鹭科具有代表性的夜鹭及鸬鹚科具有代表性的鸬鹚的卵黄抗体IgY.方法 采用了水稀释法和硫酸铵分级沉淀法粗提IgY,再过HiTrap IgY Purification HP柱子进一步纯化.结果 经两步纯化,得到了纯化的鸬鹚和夜鹭的卵黄抗体IgY ,经SDS-PAGE检测为电泳纯,夜鹭和鸬鹚的卵黄抗体的相对分子质量约为180×103.结论 证实了鸬鹚和夜鹭的卵黄抗体IgY的存在及其特性, 为这两种鸟类的卵黄抗体IgY纯化,二级抗体制备提供了参考.
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改良的硫酸铵沉淀法纯化大雁的卵黄抗体
目的 探索有效的纯化大雁卵黄抗体及高效价二抗的方法.方法 应用了PEG沉淀 ,阴离子交换柱,硫酸铵分级沉淀纯化,免疫制备二抗,免疫电泳和免疫双扩散法及western blotting 进行效价的测定.结果 改良后的硫酸铵沉淀法的纯度远远高于PEG沉淀,相对于离子交换法而言更加简单方便,经济省时.从免疫电泳看已达到了电泳纯,大雁卵黄IgY的相对分子质量为180×103,重链约为66×103,轻链约为24×103.免疫获得的二抗有较强的免疫活性.结论 用改良的硫酸铵沉淀法纯化大雁卵黄抗体,效率和纯度显著提高,值得推广.本实验为大雁卵黄抗体及其二抗的应用奠定了基础,也为雁形目其他种类卵黄抗体的纯化提供了参考.
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三种鸡形目雉科禽类卵黄抗体的纯化及二抗的制备
目的 纯化三种鸡形目雉科的禽类孔雀、鹌鹑、贵妃鸡的卵黄抗体IgY,并且免疫家兔制备抗血清.方法 采用了水稀释法,HiTrap IgY Purification HP 免疫亲和层析法和硫酸铵沉淀法纯化IgY.免疫家兔制备抗血清,免疫双扩散法测定效价.P rotein-A亲和纯化兔抗IgY血清IgG.结果 经亲和纯化和盐析纯化, 得到了孔雀、鹌鹑、贵妃鸡的卵黄抗体IgY,经SDS-PAGE检测为电泳纯, 孔雀、鹌鹑、贵妃鸡的卵黄抗体IgY的相对分子质量约为180×103.免疫后经Protein-A亲和纯化后获得了兔抗IgY的Ig G.结论 证实了孔雀、鹌鹑、贵妃鸡的卵黄抗体IgY的存在及其特性.雉科鸡形目禽类卵黄抗体的纯化方法相似,可以推广到鸡形目其它禽类的卵黄抗体的纯化中, 获得的抗血清可以进一步进行标记和今后抗原的检测.
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卵黄抗体的分离提取和纯化方法
卵黄抗体性能稳定,具有较强抵抗热酸、碱的能力,室温下可保持6个月的活性,4 ℃下放置几年活性不减,易于大规模生产等许多优点,卵黄免疫球蛋白的纯化方法和哺乳动物的纯化方法不同,包括有机物沉淀法,有机溶剂抽提法,天然胶法和水稀释法等粗提方法 ;凝胶过滤层析,离子交换层析和亲和层析等精细纯化方法.本文就卵黄抗体的分离和纯化方法的优缺点作一比较.
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Ⅳ型胶原多克隆抗体的制备及性质研究
目的：通过免疫母鸡制备抗人Ⅳ型胶原多克隆抗体（IgY），为检测人血清Ⅳ型胶原含量提供IgY。方法采用人胎盘来源的Ⅳ型胶原蛋白作为抗原，免疫Leghorn母鸡，采用PEG方法分离纯化鸡卵黄中的抗体，获得抗体粗提物。经Sephadex G100凝胶过滤制备多克隆抗体纯品。使用SDS-PAGE、免疫琼脂双向扩散等方法对提取物的含量、纯度及特异性进行鉴定。结果电泳结果显示，抗体粗提物纯度为81%。抗体纯品仅在70kd和25kd处各有一条带，纯度达到96%；免疫琼脂双向扩散实验结果显示，抗体纯品、粗品及免疫三周后鸡血清均与中心孔的抗原形成抗原抗体复合物的乳白色沉淀线。结论本研究分离纯化方法制备的抗Ⅳ型胶原IgY，具有抗体纯度高、特异性强等特点，为多克隆抗体广泛应用奠定了基础。
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抗哇巴因鸡蛋黄IgY与兔抗体IgG在酶联免疫检测中的比较
目的:探讨提高内源性哇巴因(EO)检测方法的准确性及特异性,为哇巴因的研究打下基础.方法:分别制备出鸡蛋黄抗哇巴因多克隆抗体及兔抗体.然后采用酶联免疫吸附法(ELISA)比较两种抗体检测内源性哇巴因的准确性及特异性.结果:采用IgY检测EO的平均批内变异系数为2.03%,批间变异系数为2.34%.兔抗体IgG则分别为2.83%、3.29%;两者均与氢化可的松及地塞米松无交叉结合反应,与西地兰和地高辛分别存在3.45% vs 5.95%、3.20% vs 5.20%的交叉反应.结论:IgY比兔抗体ELISA检测内源性哇巴因的特异性及准确性较高.
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卵黄囊抗体的研究进展
卵黄囊抗体即卵黄免疫球蛋白(Immunoglobulin of yolk,IgY)是抗原免疫禽类后由卵黄中分离得到的特异性抗体.与哺乳动物来源的IgG比较,卵黄囊抗体具有取材方便、分离纯化方法简单、产量高,同时具有特异性高、稳定性较好等优点,在疾病诊断、防治等诸多方面得到了广泛的应用,一直是生命科学相关科研领域的研究热点.本文仅就IgY的有关特点及其应用进行综述.
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抗三价流感病毒亚单位疫苗IgY防治小鼠流感病毒感染的实验研究
目的:探讨抗三价流感病毒亚单位疫苗IgY(Immunoglobulin Yolk)预防及治疗流感病毒感染小鼠的作用.方法:建立A/fm/1/47(H1N1)流感小鼠模型;分5组,观察各组小鼠死亡率,脾、肺指数及肺指数抑制率.结果:0.2%抗三价流感病毒亚单位疫苗IgY于攻毒前24、6、1小时滴鼻3次显著地预防流感病毒致死率(30.0%),而攻毒后1、6、24小时分别滴鼻3次,此后每天滴鼻1次,持续5天,致死率为20.0%,两组与阳性对照组(致死率90.0%)、非特异性IgY预防和治疗组(致死率80.0%,70.0%)比较差异显著(P＜0.01).0.2%抗三价流感病毒亚单位疫苗IgY预防组和治疗组肺指数显著低于阳性对照组(P<0.05～0.01),其治疗组也低于非特异性IgY预防和治疗组(P<0.05).结论:抗三价流感病毒亚单位疫苗IgY感染前后24小时内多次滴鼻能有效地预防和治疗流感病毒感染.
关键词： 小鼠 IgY 三价流感病毒亚单位疫苗 预防 治疗 -
产肠毒素大肠杆菌(ETEC)的两种抗原制品对蛋鸡免疫原性的对比研究
目的:采用产肠毒素大肠杆菌(ETEC)K88标准菌株,研究其不同浓度的菌毛及全菌两种抗原对蛋鸡的免疫原性,并确定佳的抗原浓度.方法:用SDS-PAGE鉴定菌毛蛋白的纯度,通过间接ELISA法检测特异性卵黄抗体(IgY)的效价.结果:菌毛蛋白对蛋鸡的免疫原性优于全菌;纯化的菌毛蛋白对蛋鸡的免疫原性优于粗菌毛蛋白,其诱导的抗体效价高可达1:480 000,初免84天后未见有明显的下降趋势;菌毛蛋白佳浓度为2 mg/ml,全菌佳浓度为1010 cfu/ml.结论:本研究为制备高效价特异性IgY抗体奠定了基础.
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融合蛋白VacA-HpaA卵黄抗体的体外研究
目的:研究VacA-HpaA融合蛋白的鸡卵黄抗体(IgY)的理化特性和生物学活性,为制备集预防与治疗为一体的抗H.pylori感染的制剂奠定基础.方法:以纯化的VacA-HpaA融合蛋白免疫产蛋鸡,水稀释法获取蛋黄抗体(VacA-HpaA IgY).(1)用硫酸铵沉淀法纯化IgY后,用SDS-PAGE分析其纯度,Bradford法测定蛋白含量.(2)用间接ELISA法检测该IgY的耐热性、耐酸性及其对酶消化的耐受作用.(3)采用Western blot分析IgY的特异性并检测其效价.(4)用MTT法检测不同浓度VacA-HpaAIgY对细胞毒活性的中和作用.(5)用扫描电镜观察VacA-HpaA IgY对AGS细胞粘附的中和作用.结果:(1)该IgY 纯度为60%,蛋白浓度为22 g/L;(2)具有一定的耐热性、耐酸性和耐胃蛋白酶能力;(3)Western blot分析显示IgY的特异性,在相对分子量约27 000和30 000处出现在相应的条带;(4)该IgY对VacA细胞毒活性有中和作用,且具有量效性和时效性;(5)IgY可阻止H.pylori菌体蛋白的粘附作用.结论:该IgY具有良好的理化和生物学特性,可用于制备抗H.pylori感染的防治制剂.
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抗轮状病毒IgY的研制
目的用鸡卵黄制备抗轮状病毒(RV)免疫球蛋白,预防和治疗婴幼儿RV感染.方法制备RV抗原,通过不同途径免疫母鸡,几种纯化方法联合应用从鸡卵中提取特异性鸡卵黄抗体(IgY),进行理化学检定及动物效力实验.结果免疫母鸡均可产生特异性IgY,纯度可达91%以上,产量为44mg/蛋;可保护乳鼠免受RV攻击;IgY耐热、耐酸,室温保存半年、4℃两年效价不变.结论已成功地应用RV免疫母鸡制备出高效价特异性抗RV-IgY.
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胃蛋白酶对抗狂犬病毒IgY活性的影响
目的观察抗狂犬病毒IgY经胃蛋白酶酶解24h后,抗体活性的变化.方法高效价抗狂犬病毒IgY粗提后,经胃蛋白酶酶解,纯化,用ELISA及小鼠中和实验测其抗体活性.结果获得单一IgY酶解片段并能够中和狂犬病毒.结论 IgY经胃蛋白酶酶解24h仍保持其中和抗体的活性,为制备口服免疫制剂奠定基础.
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抗SARS-CoV鸡卵黄免疫球蛋白的制备
目的制备抗SARS-CoV IgY,以期用于预防SARS-CoV感染和阻止SARS传播.方法用灭活的SARS-CoV免疫产蛋母鸡,水稀释法提取IgY,SDS-PAGE检测IgY纯度,ELISA检测IgY抗SARS-CoV的特异性和效价,中和试验检测中和效价.结果灭活SARS-CoV能诱导产蛋母鸡产生抗SARS-CoV IgY.IgY纯度达41.6%.ELISA效价达1:2 048/mg蛋白,中和效价达1:512.结论灭活的SARS-CoV免疫产蛋母鸡能够产生高效价的特异性抗SARS-CoVIgY,并能中和SARS-CoV病毒.
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鸡卵黄抗体(IgY)的诱导
目的获得鸡卵黄抗体(Igy),并研究该抗体在鸡的黄液中表达的进程.方法用吗啡一牛血清蛋白结合物为模型抗原对30周龄产蛋鸡进行免疫诱导,用ELISA间接法测定不同时间的抗体滴度.结果全程免疫过程中白蛋白抗体高滴度为1:12800,吗啡抗体高滴度为1:1600,经5次免疫后(42周龄)抗体滴度不再升高.结论为使目的抗体在鸡卵黄液中持续而高质量诱导奠定基础.
