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深圳市一般人群HGV和TTV感染的研究
为探讨深圳市一般人群中HGV和TTV感染状况及其影响因素.方法采用随机抽样法选取研究对象,对HGV感染的检测先用ELISA法检测样本中的抗-HGV,对其中阳性样本再用反转录PCR(RT-PCR)进行检测;TTV DNA则采用巢式PCR方法检测.结果表明,深圳市一般人群中HGV RNA和TTV DNA阳性率分别为2.33%和14.77%,男女阳性率HGV RNA为2.45%和2.20%,TTV DNA阳性率为17.86%和12.0%.年龄组间HGV RNA及TTV DNA阳性率差异均无显著性;单因素和Logistic回归分析未显示肝炎病史、近期手术史、注射史、拔牙史及乙型肝炎疫苗接种史等因素与HGV及TTV感染有关;HBsAg、抗-HBS和抗-HBc与HGV及TTV感染无统计学意义.不同职业人群中HGV RNA阳性率以中学生和教师较高;TTV DNA阳性率则以税务干部和教师高于其他人群,因此证明,深圳市一般人群中HGV和TTV感染率较高,但其流行因素有待进一步研究.
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无血清免疫学标志的乙肝病毒株分子生物学特性
随着聚合酶链反应法(PCR)技术广泛用于扩增血清和肝脏组织中的乙型肝炎病毒(HBV)DNA,现已发现一些乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阴性的HBV变异株[1],人感染这些HBV变异株后,无血清HBV标记,从而给诊断、治疗和预防带来困难,目前对这些变异株在HBV携带者中所占比例及其致病性尚未充分了解。因此,研究其分子生物学特性具有重要意义。本文报道一例无血清免疫学标志的原发性肝癌患者HBv变异株的分子生物学特性。
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HGV RNA逆转录套式聚合酶链反应法的优选实验
1995年,美国Simons等和Linnen等分别从肝炎患者的血清中克隆出庚型肝炎病毒(GBV-C/HGV)的基因组,并建立了检测血清GBV-C/HGV RNA的逆转录套式聚合酶链反应(RT-nPCR)方法.但是,该检测方法的灵敏度存在着较大差异.本实验使用A~E共5套PCR引物,基中A、B、D为自行设计的HGV 5′端非编码区引物,目的产物长度分别为368bp, 158bp及220bp;C引物为参照文献设计的核心区引物,目的产物为302bp;E引物为李倬副研究员设计的NS3区引物,目的产物长度为591bp.采用改良的异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取HGV RNA,套式逆转录聚合酶链反应(RT-nPCR).
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微流控芯片电泳技术检测肿瘤患者血浆中p16基因甲基化的应用
p16基因甲基化是癌症诊断的标志物之一.目前检测p16基因甲基化的甲基化特异性聚合酶链反应法(MSP)[1]灵敏度有限,对血浆中脱落肿瘤细胞少的标本易报告为假阴性.而微流控芯片电泳技术具有高灵敏度、成本低、分析速度快等特点[2].本研究用微流控芯片电泳技术检测肿瘤患者血浆中p16基因异常甲基化,并探讨其临床应用价值.
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逆转录聚合酶链反应法定量检测汉坦病毒RNA在临床诊断中的价值
我国是肾综合征出血热(HFRS)危害为严重的国家之一,对HFRS患者进行汉坦病毒定量研究,对疾病的诊断和治疗及流行病学调查等防治实践有极为重要的意义.
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用逆转录聚合酶链反应法检测人巨细胞病毒晚期mRNA
人类HCMV感染非常普遍,在成人可达80%~96.74%[1],而只有活动性感染才可导致病理性损害.因此建立一个快速、准确、敏感的HCMV活动性感染的检测方法,对HCMV感染的诊断和治疗具有重要意义.我们采用逆转录PCR(RT-PCR)方法,通过检测HCMV晚期基因的转录产物-mRNA,初步建立了一个HCMV活动性感染的检测方法,报道如下.
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基因表达谱芯片技术筛选NS5ATP11反式调节基因
目的:应用基因芯片技术研究未知功能基因NS5ATP11的表达对于肝细胞基因表达谱的影响.方法:从HepG2细胞RNA中用反转录聚合酶链反应法(RTPCR)扩增出NS5ATP11编码区DNA,常规分子生物学技术构建NS5ATP11的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP11,利用脂质体转染技术转染HepG2细胞,NS5ATP11的表达以Western blot杂交技术证实.从转染和非转染细胞HepG2种提取总mRNA,逆转录为cDNA,并进行基因芯片技术分析.结果:证实构建pcDNA3.1(-)-NS5ATP11在HepG2细胞中表达正确.NS5ATP11重组表达载体和空白载体转染的HepG2细胞的基因表达改变进行分析.结果表明,8种基因的表达水平上调,10种基因的表达水平下调.结论:NS5ATP11对于肝细胞基因表达谱存在一定影响;基因芯片技术是分析蛋白反式调节基因表达谱的重要技术途径,有助于了解NS5ATP11对肝细胞和其他生物学功能的调节作用.
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基因表达谱芯片技术筛选肝再生增强因子反式调节基因
目的:为了阐明人肝再生增强因子(augmenter of liverregeneration,ALR)的表达对于肝细胞基因表达谱的影响,我们应用基因芯片技术,对于转染和未转染的HepG2细胞进行了分析.方法:从HepG2细胞RNA中用反转录聚合酶链反应法(RT-PCR)扩增出ALR编码区DNA,常规分子生物学技术构建ALR的真核表达载体pcDNA3.1(-)-ALR,利用脂质体转染技术转染HepG2细胞,ALR的表达以Western blot杂交技术证实.从转染和非转染细胞HepG2种提取总mRNA,逆转录为cDNA,并进行基因芯片技术分析.结果:经过限制性内切酶分析和序列测定,证实pcDNA3.1(-)-ALR构建正确.ALR在HepG2细胞中的表达以Westernblot杂交技术得到证实.对于ALR重组表达载体和空白载体转染的HepG2细胞的基因表达谱,利用基因芯片技术进行分析.结果表明,2种基因的表达水平上调,24种基因的表达水平下调.这些基因包括淀粉酶α、肿瘤坏死因子受体、金属蛋白酶1组织抑制因子、性激素相关蛋白等基因,相信这些类型的基因在ALR所发挥的生物学效应起到重要的作用.结论:ALLR于肝细胞基因表达谱存在一定影响;基因芯片技术是分析蛋白反式调节基因表达谱的重要技术途径,有助于了解ALR对肝细胞和其他生物学功能的调节作用.
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慢型丙型肝炎患者干扰素治疗前后HCV HVR1准种的动态变化
目的:探讨感染HCV1b型慢型丙型肝炎患者HCV HVR1区准种的复杂性与干扰素疗效的关系,以便对干扰素治疗疗效进行预测.方法:应用IFN治疗的慢性丙型肝炎患者共20例,于治疗前、治疗后3 mo、6 mo留取血清,-70℃冻存待测.治疗方案为:干扰能3 mu,3次/wk,肌肉注射,共24 wk.HCV HVR1准种的检测采用单链构象多态性聚合酶链反应法(SSCP法).结果:IFN治疗前,35%(7/20)的患者表现为SSCP低复杂性(SSCP条带数≤3),65%(13/20)表现为高复杂性(SSCP条带数>3).治疗3 mo后,4例患者HCV RNA阴转,均发生在低复杂性组,其余大部分患者SSCP条带数减少1-2条带.治疗6mo时,7例患者HCVRNA阴转,仅2例发生在高复杂性组.治疗结束时13例(65%)无应答患者中,8例患者SSCP条带数均较治疗前减少,2例无变化,1例恢复到治疗前水平,2例较治疗前升高.结论:HCV HVR1区准种的复杂性可以对IFN治疗进行疗效预测,治疗前准种数少者可预测对IFN治疗有较好的应答.
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食管鳞癌中COX-2 mRNA的表达以及NSAID对其的影响
目的:检测人类食管鳞癌组织和细胞中COX-2 mRNA的表达及NSAID对其的影响,探讨COX-2与食管鳞癌发病机制之间可能存在的关系.方法:用逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测22例食管鳞癌患者液氮冻存的食管鳞癌组织和癌周正常食管鳞状上皮组织标本COX-2 mRNA的表达.将人类食管鳞癌细胞株与阿司匹林或尼美舒利共同孵育后,用噻唑蓝法定量检测细胞增生情况,用RT-PCR法检测其COX-2 mRNA的表达情况.结果:在22例食管鳞癌组织标本中有12例(54.5%)COX-2mRNA表达阳性,但在癌周正常食管鳞状上皮组织标本均未检测到COX-2 mRNA表达.细胞培养结果表明,阿司匹林和尼美舒利对EC-9706细胞株的增生和COX-2 mRNA表达均有影响;但对EC-109细胞株,仅阿司匹林对细胞的增生和COX-2 mRNA表达有影响.结论:人类食管鳞癌常表达COX-2 mRNA,提示COX-2有可能在食管鳞癌的发生机制中起重要作用,而且NSAID很可能有助于预防和治疗此病.
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实时荧光定量聚合酶链反应法检测痰结核杆菌DNA及其临床应用
结核杆菌培养法周期长,而且存在药物抑菌现象,容易产生假阴性结果.痰涂片抗酸染色计数法在敏感度、特异度等方面均不理想.本研究采用Taqman荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术,检测痰标本结核杆菌载量的实时荧光定量PCR体系,评价该体系检测结核杆菌以及监控抗结核药效的可行性.
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胎儿ABO血型的产前诊断
母儿血型不合中以ABO血型不合多见,常导致早期流产、胎儿贫血、水肿、甚至胎死宫内.为探讨产前诊断胎儿ABO血型的简便、准确、敏感性高、特异强的方法,我们根据B基因、A2基因、O1基因、O2基因与A1核苷酸序列突变位点的不同,设计出相应的特异性引物,用特异性序列-聚合酶链反应法,对2000年3月~2001年9月,在我院产科分娩的56例未破膜孕妇(新生儿、胎儿)及其丈夫[其中足月分娩28例(剖宫产23例,阴道分娩5例),引产28例(死胎9例,妊娠合心脏病2例,肺部恶性肿瘤1例,再生障碍性贫血2例,胎儿畸形8例,妊娠合并糖尿病酮症酸中毒1例,重度妊高征2例,羊膜带综合征1例,胎儿生长受限并巨细胞病毒感染2例)]进行羊水细胞A1、A2、B、O1、O2血型基因型检测.
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四种方法检测淋病奈瑟球菌的临床应用对比研究
目的:探究与分析四种检测法在淋病奈瑟球菌的临床应用。方法:选取我院自2012年8月至2014年8月收治的400例疑似淋病奈瑟菌感染患者作为临床研究对象,分别给予以下四种检测方法包括直接涂片染色法、培养鉴定法、聚合酶连反应法及斑点金免疫渗滤法对标本进行检测,以培养鉴定法作为对照组,对比四组检测方法对淋球菌的阳性检出率以及检测淋球菌的符合度情况。结果:培养鉴定法与斑点金免疫渗滤法阳性检出率相比无显著差异(χ2=2.89,P >0.05);培养鉴定法分别与直接涂片染色法、聚合酶连反应法阳性检出率相比具有显著差异(χ2=4.35,P <0.05;χ2=4.57,P <0.05)。培养鉴定法与聚合酶连法在检测淋球菌方面存在一致性(K =0.890,P <0.05),而培养鉴定法与直接图片染色法及斑点金免疫渗滤法均不存在一致性(P >0.05)。结论:在临床工作中对微生物进行诊断时建议选择两种以上的检测方法以保证阳性检出率,为临床治疗提供合理依据。
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从中国14个城市戊型肝炎病人血清中检测到的戊型肝炎病毒部分核苷酸序列分析
目的调查从中国病人血清中分离的戊型肝炎病毒(HEV)基因型。方法 应用聚合酶链反应法(PCR)和直接测序法对从中国14个城市检测到的45株HEV开放读码框架2(ORF2)的部分基因序列(nt6461-6860及nt5994-6294)进行分析。结果 45株HEV中,41株(91%)与缅甸株属同一个基因型,与中国代表株HEV核苷酸序列的同源性均在98%以上。 仅4株与3个HEV原型株差异较大,与缅甸株/中国株同源性为77%-80%,与墨西哥株的同源性为74%-76%,与新发现的美国株/猪(US/Swine)HEV的同源性为74%-77%;基因进化树分析表明,该4株HEV可能为一新基因型的2个不同亚型,它们与原型墨西哥株、缅甸株和美国株/猪HEV明显不同。结论 中国戊型肝炎患者中,多数感染中国原型株HEV,仅少数感染新基因型HEV。
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双重聚合酶链反应法早期诊断军团菌肺炎的初步研究
据<中华内科杂志>2001年3月40卷第3期报道 为探讨双重聚合酶链反应(DPCR)法检测痰及支气管肺泡灌洗液(BALF)中军团菌DNA在早期诊断军团菌肺炎的意义,北京同仁医院呼吸科金建敏医师采用DPCR对军团菌肺炎组(15例)和普通肺炎组(31例)患者病程早期留取的痰及BALF进行军团菌DNA检测.用军团菌16S rRNA基因和mip基因序列引物,扩增386bp 16S rRNA基因片段和206bp mip基因片段.通过模拟标本检测DPCR方法用于临床标本时的灵敏度.
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共刺激因子 B7-H4在膀胱癌中的表达及意义
膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一,具有高复发性。近年来国内外众多研究一直致力于寻找与膀胱癌发生发展及复发有关的分子标志物。B7-H4是新近发现的 B7-CD28超家族的成员。研究发现 B7-H4在卵巢癌、肾细胞癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌及胰腺癌中都有过度表达[1-4],有望成为肿瘤生物治疗的潜在靶点。因此,我们应用反转录聚合酶链反应法(RT-PCR)和免疫组织化学的方法,分别检测膀胱癌及癌旁正常组织中 B7-H4 mRNA 和 B7-H4蛋白的表达情况,同时分析其表达与膀胱癌临床病理学特征及膀胱癌复发之间的关系,以期探讨共刺激因子 B7-H4可能在膀胱癌发生发展过程中所起的作用。
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聚合酶链反应法检测宫颈分泌物中病原微生物样本采集方法研究
聚合酶链反应(PCR)技术以其基因扩增的灵敏性、分子杂交的特异性和光谱技术的精确定量等优点,在血液和体液病毒、病原微生物定量检测中发挥了重要作用.但是长期以来,由于人们对宫颈分泌物定量检测重视程度较差,文献[1,2]曾研究过用接种环和棉拭子取样进行阴道菌群的定量,但由于分泌物的黏度、密度不同,用接种环定量体积的方法本身不合理,棉拭子取样由于没有好的释放方法,结果均不理想.文献[3,4]报道常常可看到用定量试剂盒检测未经定量的分泌物,而得出的结果却冠以"定量"二字.这对于拥有现代化仪器的实验室是一种资源浪费,同时对诊断也是一种误导.为了向临床和科研提供真正定量的分析结果,我们对宫颈分泌物定量分析问题进行了研究,现报告如下.
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HCV-RNA的荧光定量PCR检测
丙型肝炎病毒(HCV)感染是导致慢性肝炎的主要原因,据估计约80%的HCV感染者会发展为慢性化,其中近20%的患者有可能进一步发展成肝硬化,而肝硬化患者发展成肝癌的机率为1.5%~4%[1,2].因此,对于HCV感染的早期诊断和治疗非常重要.近几年采用荧光定量聚合酶链反应法(Fluorescent Quantitative Polymerase Chain Reaction,FQ-PCR)对丙型肝炎的早期诊断、治疗期间抗病毒药物的疗效评价、感染人群的普查以及污染源的检测均有较高的使用价值[3,4].本研究应用FQ-PCR方法定量检则132例慢性丙型肝炎患者血清中HCV-RNA的水平并与丙氨酸氨基转移酶(ALT)浓度及抗-HCV滴度进行比较,以探讨HCV-RNA定量检测的实际应用意义.
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聚合酶链反应法在溶脲脲原体分群鉴定中的应用进展
溶脲脲原体包括14个血清型,分为2个生物群.溶脲脲原体可以引起绒毛膜炎、早产、流产、新生儿肺炎、慢性肺病等疾病.许多研究认为溶脲脲原体2个生物群的致病性是有差异的.因此,临床上需要一种能够对溶脲脲原体分群鉴定的诊断方法.鉴于聚合酶链反应在微生物学领域的广泛应用,本文对近年来各种聚合酶链反应在溶脲脲原体分群鉴定中的应用进行了综述.
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029 用多探针定量聚合酶链反应法进行病原菌的检测和鉴定
目前临床上对病原细菌的标准检出方法仍为分离培养,此法耗时且可能出现假阴性。聚合酶链反应(PCR)由于其快速、灵敏的特点而被推荐用于病原菌的检出。针对细菌保守的16S rRNA设计引物……