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HGV RNA逆转录套式聚合酶链反应法的优选实验
1995年,美国Simons等和Linnen等分别从肝炎患者的血清中克隆出庚型肝炎病毒(GBV-C/HGV)的基因组,并建立了检测血清GBV-C/HGV RNA的逆转录套式聚合酶链反应(RT-nPCR)方法.但是,该检测方法的灵敏度存在着较大差异.本实验使用A~E共5套PCR引物,基中A、B、D为自行设计的HGV 5′端非编码区引物,目的产物长度分别为368bp, 158bp及220bp;C引物为参照文献设计的核心区引物,目的产物为302bp;E引物为李倬副研究员设计的NS3区引物,目的产物长度为591bp.采用改良的异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取HGV RNA,套式逆转录聚合酶链反应(RT-nPCR).
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固相载体法提取胰腺癌患者血清循环DNA的研究
近年研究发现,肿瘤患者血清或血浆中存在较高水平的肿瘤源性DNA(亦称循环DNA),正常人血清或血浆中的含量甚微(<10ng),因而对其遗传学改变进行检测,对肿瘤的诊断、鉴别和治疗预后等具有重要意义[1].然而,血清中含有的大量蛋白质、糖类、脂质等均可影响微量循环DNA的提取,而分离纯化则是准确检测的关键步骤.本研究采用全血基因组DNA提取的异硫氰酸胍-硅胶法[2]与高灵敏度的SYBR GreenⅠ染色技术,建立了一种可提取血清或血浆DNA的固相载体法,并用于胰腺癌患者血清循环DNA检测.
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一种从脑脊髓液中提取病毒RNA和DNA的新方法
从真核细胞中提取总RNA和DNA的方法很多[1],均需从大量细胞和大量临床样本中分离、纯化核酸.从标本中提取靶DNA或RNA的多少是聚合酶链反应(PCR)和逆转录PCR(RT-PCR)方法敏感性的关键,尤其是某些感染性疾病早期标本中只有微量病毒分子时更是如此.因此,许多新方法和传统方法经修改后[2~5]都致力于病毒滴度很低的临床小样本的检测.本实验应用单一异硫氰酸胍裂解缓冲液分离脑脊髓液(CSF)中的RNA和DNA,旨在建立一种适于临床小样本的有效、快速、简单的核酸提取方法.
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RNA快速提取一步法的建立
RNA是分子生物学研究的一个重要组成部分, 不论是cDNA文库的构建、RT-PCR、RNA序列分析、差异显示(mRNA differential display)、代表性差异分析 (representational Difference Analysis, RDA)、抑制性消减杂交(suppression Subtraction Hybridization, SSH)、Northern印迹分析、蛋白质的体外翻译等均依赖于高纯度完整的RNA. 因此, 如何获得高质量的RNA是研究人员关注的问题.1987年Chomczynski等[1]建立了酸-异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法(acid-guanidine-phenol-chloroform, AGPC).该方法较以往的传统方法操作简单,无需特殊的设备,抽提时间缩短至4 h,因而得到广泛的应用.数家公司据此开发出RNA提取试剂盒[2,3].使用试剂盒简单方便,但价格相对昂贵.为探索操作简便、经济实用、快速有效的RNA提取方法,我们分析了大量相关文献资料,进行了多次实验,成功地研制出一种新型的RNA提取试剂,建立了其操作程序,我们称之为RNA快速提取一步法.其性能达到进口试剂盒的水平,但造价低廉、操作简便,特别适用于国内实验室.
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长期冻存和新鲜胃癌组织总RNA提取方法的比较
背景:目前两种可靠、应用广的高通量RNA分离技术是基于异硫氰酸胍-酚︰氯仿的RNA分离技术和基于硅胶柱的RNA分离技术.在临床应用非常有限的组织材料时,有必要对RNA分离技术的可重复性和可靠性分别进行先期评价.目的:系统比较采用硅胶柱法和Trizol法从冻存、新鲜胃癌组织中分离总RNA的效果.方法:硅胶柱法和Trizol法分别提取长期-80 ℃冻存的(2年以上)和新鲜胃癌组织总RNA,紫外分光光度法比较RNA纯度,琼脂糖凝胶电泳分析28 S和18 S吸光度比值,进一步通过实时反转录-聚合酶链反应对扩增距mRNA polyA尾端不同大小片段的Ct值进行比较,间接判断不同大小mRNA的拷贝数及完整性.结果与结论:硅胶柱技术和Trizol方法在总RNA提取的纯度方面都表现很好.然而在RNA完整性方面,基于硅胶柱技术的提取方法要好于Trizol法,因为其核糖体RNA形式完好而且更好地保持了不仅短的及中等大小片段,对于较大的mRNA片段也保持更好.另外,与新鲜组织相比,长时间冻存对胃癌组织总RNA提取的影响很小.
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DCS细胞中SRS19-6白血病病毒3’-cDNA序列的克隆
利用本室建立的树突状细胞肉瘤(dendritic cell sarcoma,DCS)细胞系免疫Lou/c大鼠,制 备了细胞膜蛋白单克隆抗体983D4,该抗体具有小鼠肿瘤细胞的特异性,能抑制体外细胞生 长 速度,降低克隆形成能力[1]。为了得到其cDNA序列,本工作构建了DCS细胞cDNA表 达文库并用983D4单抗进行了免疫学筛选。1 材料与方法1.1 细胞总RNA的提取及cDNA合成 用异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提一步法 [2]提取DCS细胞总RNA,oligo-dT纤维素层析柱(Gibco-BRL)分离mRNA后,按照Gibc o-BRL公司逆转录试剂操作说明,分别用MMLV逆转录酶和E.coli DNA聚合酶I作用下合成cD NA第一、二链,Sephacryl S-400离心柱除去小分子cDNA。
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正常和去卵巢大鼠骨组织白细胞介素6 mRNA表达水平的研究
绝经后妇女由于卵巢功能低下,雌激素明显减少,导致骨重建偶联过程失衡,骨吸收超过骨形成,终致骨量减少,骨强度降低,出现骨质疏松.近年来,雌激素对细胞因子的调节在绝经后骨质疏松(postmenopausal osteoporosis,PMO)发病中的作用受到重视.本实验旨在探讨雌激素对白细胞介素(IL-6)基因表达的调节及其与骨密度之间的关系.一、材料和方法1.主要试剂及仪器:RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、Taq酶、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇及DEPC均为Promega产品.DNA markers(SABC)购自华美公司,引物由上海生物工程公司合成.雌激素试剂盒为天津德普生物公司产品,尼尔雌醇为北京四环二厂产品.十二烷基肌氨酸钠、琼脂糖均为本室进口试剂.其他试剂均为国产分析纯.
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核酸提取方法的改进
实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)广泛应用于RNA病毒的核酸检测,而前期的RNA提取效率高低直接影响到检测效率,以往病毒RNA提取主要采用异硫氰酸胍-酚-氯仿及TRIzol法[1-3]等,但操作步骤都较繁琐,且易造成污染而出现假阳性.近些年,公共卫生紧急事件频发,国内市场一直致力于探索提取效率高、耗时短、成本低的病毒RNA提取试剂的研发.RNA易被RNA水解酶(RNase)水解,排除RNase的污染是RNA制备成功与否的关键因素,RNase的生物活性非常稳定,加热煮沸均不能使其完全失活,冰浴条件下操作是减低RNase活性的有效措施[4],而一些国产试剂及我们实验室使用的德国罗氏公司的RNA提取试剂在RNA提取操作过程中有72℃放置10min的温浴操作一步,其意义不甚明瞭,而这步操作不仅费时,在温浴过程中还易产生气溶胶、试管爆盖等因素,增加了实验过程中实验室污染的几率.因此,我们进一步做了比对试验,比较改进后的方法与原试剂说明书中方法的检测结果,以验证72℃放置10min的温浴操作的意义,现将结果报告如下.
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聚合酶链反应快速检测念珠菌属
病原真菌因具有特殊的细胞壁结构,故聚合酶链反应 (PCR)检测方法自建立以来一直需要经过反复的真菌破壁和 DNA抽提过程才能获取提纯的 DNA,以进行下一步的 PCR检测 [1- 3]。近来有学者已使用基因释放剂、 CTAB及异硫氰酸胍等 [4- 6]对真菌菌株或临床标本进行前期处理,然后进行 PCR检测,但这仍需要配制复杂的原生质体形成缓冲液、原生质体裂解缓冲液 [6]等,或者高额购买商品化的基因释放剂 [4,5],这不仅需要较高的技术要求、较大的实验成本、经过一定训练的技术人员,还要历经较长的实验时间,严重限制了真菌病 PCR检测方法在临床的应用和普及。因此我们以念珠菌属作为突破口,对其破壁—破膜—释放 DNA系列程序的条件及相应的 PCR扩增体系作了反复研究,终获得了一种简便、快速的 PCR检测方法,现介绍如下。
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简便快速抽提大鼠少量脑组织总RNA的改良
目前抽提组织中总RNA的方法很多,但步骤均较复杂,且时间较长、费用较高、收得率低、本方法在Chomczyski等介绍的异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法的基础上,结合自己的实验体会,提出了一种在抽提少量脑组织(约100mg)标本时仍能得到完整的、纯度较高的总RNA的改良方法,且总RNA的收得率也较高.
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人外周血白细胞雄激素受体基因表达的研究
目的:建立分子生物学检测方法研究雄激素受体(AR)在正常人外周血白细胞mRNA表达.方法:选择健康成年人,抽取静脉血,分离白细胞,采用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法抽提总RNA,分别采用Northern blot、 RT-PCR等方法检测AR mRNA的表达.结果:Nortern blot检测结果显示白细胞AR mRNA长约9.4 kb,与Lubahn等报道的人前列腺组织ARmRNA大小相同;RT-PCR方法则得到了390 bp ARcDNA片段,两种方法均证实了AR在人白细胞中的表达,表明雄激素通过AR对白细胞功能有一定影响.结论:正常人外周血白细胞ARmRNA检测方法的建立为研究雄激素影响白细胞功能的机理奠定了基础;RT-PCR方法取材方便,用血量少,为探讨病理情况下AR的改变提供了新的途径.
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病毒RNA提取试剂对甲型流感病毒的灭活效果
目的 测试病毒RNA提取试剂(硅胶柱法和改良异硫氰酸胍法)灭活甲型流感病毒的能力,以评估在低防护区操作甲型流感病毒核酸提取过程的可能性.方法 根据试剂盒操作指导分别用两种提取试剂的裂解液Buffer AVL(德国QIAGEN)和MGTC溶液(广州华银)处理一甲型流感2009年大流行株(105.67TCID50/ml);系列对数稀释病毒处理液后接种于MDCK细胞单层进行分离培养;倒置显微镜每日观察细胞生长状态,出现75%以上病变后收获培养物进行血凝实验测定.同时设置试剂对照以了解试剂的细胞毒性,病毒对照以确定病毒的感染能力.结果 未稀释和10倍稀释的两种裂解液都可引起MDCK大范围死亡,两病毒对照感染细胞的终点稀释度都为104,而所有102稀释度以上的病毒处理液培养孔细胞生长良好,血凝实验阴性.结论 两种病毒RNA提取试剂可以完全灭活高滴度的甲型流感病毒,标本裂解处理后可在低防护区域操作.
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岩黄连总DNA不同提取方法的比较
目的:比较4种提取岩黄连总DNA的方法,以获得高质量的DNA样品.方法:分别以十六烷基三甲基溴化胺、加酶洗衣粉、异硫氰酸胍、惰性高分子吸附柱法提取岩黄连总DNA,测定其纯度(以RA260/A280计)和提取率.结果:4种方法得到样品的RA 260/A280分别1.832 9、1.699 2、1.812 2、1.813 6;提取率分别为140.20、69.56、132.50、143.12μg·g-1.结论:4种方法都能获得质量较好的DNA样品,其中,加酶洗衣粉法的提取率相对较低,而异硫氰酸胍法和吸附柱法快速简便,可用于标本量少的试验.