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两种核酸提取方法对小鼠诺如病毒RNA提取效能的比较
目的 比较两种核酸提取方法对小鼠诺如病毒RNA的提取效能.方法 用Trizol提取法和QIAamp Viral RNA Mini Kit提取法分别提取感染小鼠诺如病毒(Murine Norovirus,MNV)的小鼠小肠组织样品RNA和细胞培养物RNA,测定RNA浓度;用MNV特异的引物对分离的核酸样品进行一步法RT-PCR扩增.结果 Trizol提取法提取小肠组织的RNA浓度高于QIAamp Viral RNA Mini Kit提取法;QIAamp Viral RNA Mini Kit提取得到的细胞培养物RNA浓度高于Trizol提取法.经QIAamp Viral RNA Mini Kit提取的两种核酸样品均能扩增出特异条带,而Trizol提取的核酸样品未见特异条带.结论 在MNV的检测中,QIAamp Viral RNA Kit更适合组织样品中MNV病毒核酸的提取.
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改良TRIzol法提取肿瘤细胞琼脂克隆的总RNA
琼脂克隆形成实验是肿瘤研究领域中一种重要的体外实验，可用于筛选转化细胞、评价肿瘤细胞药物敏感性[1]等.有研究表明,琼脂克隆形成实验筛选的肿瘤细胞具有肿瘤干细胞的特性[2],有更强的致瘤性和转移能力[3].
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家兔脂肪组织总RNA提取方法的比较
目的 对2种常用的脂肪组织总RNA提取方法进行比较,优选出脂肪组织提取的方法.方法 取家兔新鲜脂肪组织,分别用2种不同的方法提取总RNA:1.离心柱法:用UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒处理脂肪组织.2.Trizol法:利用传统Trizol法手提总RNA.提取后对2种不同的方法提取的总RNA进行比较.结果 传统Trizol法提取的总RNA的纯度及完整性均较高,优于离心柱法.Trizol法和UNIQ-10离心柱法提取的总RNA分别取3个样品进行测定,其A260/A280的平均值分别为1.598和1.562.结论 用Trizol法提取的脂肪组织总RNA效果较好,优于离心柱法.
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长期冻存和新鲜胃癌组织总RNA提取方法的比较
背景:目前两种可靠、应用广的高通量RNA分离技术是基于异硫氰酸胍-酚︰氯仿的RNA分离技术和基于硅胶柱的RNA分离技术.在临床应用非常有限的组织材料时,有必要对RNA分离技术的可重复性和可靠性分别进行先期评价.目的:系统比较采用硅胶柱法和Trizol法从冻存、新鲜胃癌组织中分离总RNA的效果.方法:硅胶柱法和Trizol法分别提取长期-80 ℃冻存的(2年以上)和新鲜胃癌组织总RNA,紫外分光光度法比较RNA纯度,琼脂糖凝胶电泳分析28 S和18 S吸光度比值,进一步通过实时反转录-聚合酶链反应对扩增距mRNA polyA尾端不同大小片段的Ct值进行比较,间接判断不同大小mRNA的拷贝数及完整性.结果与结论:硅胶柱技术和Trizol方法在总RNA提取的纯度方面都表现很好.然而在RNA完整性方面,基于硅胶柱技术的提取方法要好于Trizol法,因为其核糖体RNA形式完好而且更好地保持了不仅短的及中等大小片段,对于较大的mRNA片段也保持更好.另外,与新鲜组织相比,长时间冻存对胃癌组织总RNA提取的影响很小.
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利用甲型流感病毒阳性临床标本制备质控品
目的 制备一种能适用于甲型流感病毒核酸提取和PCR检测全过程的质控品.方法 采用TRIzol试剂灭活高、中、低3种浓度的甲型流感病毒阳性的痰液标本,分析TRIzol试剂对检测结果的影响;放置于35℃以及反复冻融,评估灭活后标本的稳定性;并在不同实验室间采用不同试剂进行适用性评价.结果 TRIzol试剂对核酸检测无影响,处理后的高、中、低浓度标本反复冻融40次病毒浓度无明显降低,变异系数分别为1.26％、1.54％、1.54％,均低于试剂盒批内精密度.TRIzol试剂处理的标本在35℃环境保存40 d后高、中、低浓度变异系数分别为3.13％、2.77％、2.20％,变异系数均低于试剂盒批间精密度.在不同单位采用不同试剂均能检测出高、中、低不同浓度质控品.结论 采用TRIzol试剂灭活甲型流感病毒阳性标本制备的质控品在瓶间差、热稳定和长期保存时效等方面性能较优,可成为日后临床实验室开展甲型流感病毒核酸检测的理想质控品.
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改进Trizol一步法提取人晶状体囊膜组织及培养的晶状体上皮细胞中总RNA
目的改进传统一步法,尝试从人晶状体囊膜和培养的晶状体上皮细胞中提取质量满意的总RNA.方法将人晶状体前囊膜和培养的牛晶状体上皮细胞分别随机分为标准组和对照组,分别采用常规一步法和改进法提取总RNA,通过测OD值、做变性胶电泳和RT-PCR反应检测改进法是否可提高微量组织或细胞的RNA产量,并验证其纯度和完整性.结果相同标本量条件下,改进组RNA产量均高于标准组数倍;变性胶电泳28S:18S=2:1,各组RNA产物经RT-PCR反应均可扩增出220bp的目的基因,而阴性对照反应均得到阴性结果,可认为是完整的未降解的无污染的RNA.结论改进一步法可成功地提取毫克级组织和104个细胞的总RNA,产物完整无降解并可用于下一步反应.
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改进TRIZOL法提取基因组DNA
目的建立一种在提取总RNA的同时又能制备基因组DNA的方法.方法利用TRIZOL法收集水相沉淀总RNA后余下的中间层和有机相,合并去除蛋白质,再提取基因组DNA.通过紫外分光光度法和电泳法予以鉴定,并以之为模板进行PCR扩增鉴定.结果提取的基因组DNA纯度和浓度俱佳,用于PCR扩增效果良好.结论改进的TRIZOL法可以更加充分地利用实验材料,且可靠易行.
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改进Trizol法提取白色念珠菌总RNA初探
目的:比较Trizol法、改进Trizol法和超声粉碎法提取白色念珠菌总RNA产量、纯度和完整性的差异.方法:对生长至静止期的白色念珠菌标准株ATCC10231分别采用Trizol法、改进Trizol法和超声粉碎法提取总RNA,用紫外分光光度计测量其A260,A280的值,并进行琼脂糖凝胶电泳,对总RNA的产量、纯度和完整性进行比较.结果:三种方法提取白色念珠菌总RNA产量分别为1.904 μg、7.208 μg和5.000 μg,A260/A280比值分别为1.896、1.415和1.612.电泳结果显示改进Trizol法提取的总RNA呈现28 s rRNA,18 s rRNA和5 s rRNA三条清晰的条带,而Trizol法和超声粉碎法提取的总RNA均有降解.结论:改进Trizol法提取的白色念珠菌总RNA产量及纯度均高于Trizol法和超声粉碎法,且完整性更好.该法优于Trizol法和超声粉碎法.
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大鼠脑组织中高质量RNA的提取
目的为探諸rizol试剂提取大鼠脑组织高质量RNA的适取样量范围.方法在1mLTrizol试剂中分别加入100,50,25,12.5mg大鼠脑组织,提取其总RNA.结果每毫升Trizol中加入组织12.5mg时,提取的RNA完整性好,纯度亦高.结论从大鼠脑组织中提取到高质量RNA,每毫升Trizol中加入脑组织适取样量范围为10～20mg.
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大鼠海马组织RNA、DNA和蛋白质共提取方法的研究
目的 探讨Trizol法同时提取大鼠单侧海马组织RNA、基因组DNA和蛋白质的可行性及优势.方法Trizol法提取成年雄性Sprague-Dawley大鼠单侧海马组织RNA、基因组DNA以及蛋白质; 商业化试剂盒提取另一侧海马组织基因组DNA,RIPA裂解液提取蛋白质.用超微量分光光度计和SYBR实时定量RT-PCR法检测Trizol法提取的RNA的质量,利用超微量分光光度计和聚合酶链式反应(PCR)法比较两种方法提取DNA的效果及质量,采用Western blot法比较两种方法提取蛋白质的效果.结果 Trizol法提取单侧海马RNA的质量浓度介于1178.3～2225.8ng/μL之间,A260/280介于2.01～2.03,A260/230介于1.88～2.22,并获得了稳定的β-actin和GR循环域值.Trizol法和试剂盒提取单侧海马DNA的质量浓度分别介于215.7～271.8ng/μL和268.6～872.5ng/μL之间,均适于充当PCR反应模板.Trizol法和RIPA裂解液提取的蛋白质在Western blot法检测目的 蛋白含量的过程中均呈现清晰的条带.结论 Trizol法提取大鼠单侧海马组织RNA的同时提取的DNA和蛋白质,与商业化试剂盒和RIPA裂解液从不同海马组织中分别提取基因组DNA和蛋白质的效果相当.采用Trizol法同时提取海马组织的RNA、DNA和蛋白质,不仅提高了实验效率、节约了实验成本,而且有效避免了因反复实验操作带来的人为干扰及误差.
