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槲寄生总RNA的快速提取方法
分子生物学实验中总RNA提取质量的好坏是关系基因克隆、Northern杂交及建立cDNA文库非常重要的前提.本文以药用植物槲寄生为材料进行总RNA的提取,为将槲寄生的药用价值应用于实践中奠定了良好的基础.
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半夏块茎高质量总RNA提取的一种有效方法
目的:探讨一种有效提取半夏块茎总RNA方法.方法:以半夏试管苗的叶片、叶柄和块茎为试验材料,将常规的异硫氰酸胍提取植物总RNA的方法做了改进,在RNA提取缓冲液中加入高浓度的β-巯基乙醇以除去酚类物质,用酸酚/氯仿抽提去除蛋白质污染,以及利用异丙醇和醋酸钠联合沉淀多糖等手段,建立了一种简单实用的从富含多酚类和多糖等物质的植物材料中提取总RNA的方法.结果:该方法所提RNA的A260/A230均大于2.0,A260/A280的值为1.7～2.0,电泳条带清晰,RNA完整性好.结论:利用本方法提取的半夏试管小块茎总RNA具有很高的质量和纯度,且得率很高,完全满足后续的DDRT-PCR和反向Northern blotting等分子生物学研究,而且简单经济、实验结果稳定,重复性好,适合富含多酚类和多糖等物质的药用植物组织总RNA的提取.
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五种破壁方法提取贵阳腐霉Pythium guiyangense总RNA效果的比较
为了探索提取贵阳腐霉Pythium guiyangense菌株总RNA简便而有效的方法,我们分别采用石英沙研磨、超声波破碎、液氮研磨、液氮加石英沙研磨和溶菌酶消化5种方法破碎真菌细胞壁,再用市售RNAsimple total RNA kit试剂盒提取总RNA,后通过对提取物进行琼脂糖凝胶电泳定性、紫外比色定量及PCR检测来评价各种破壁方法的优弊.结果显示液氮加石英沙研磨破壁法提取的真菌总RNA在5种方法中效率高,OD260/OD280=2.093±0.264,RNA浓度为(0.134±0.021)μg/μL,RNA制备效率为(26.76±4.10) μg/g菌丝体,并且该方法操作简便,重复性好,是制备P.guiyangense菌株总RNA的首选破壁方法.
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外照射对体外培养的小细胞肺癌细胞系的总RNA及多药耐药基因的影响
目的观察分次外照射对NCI-H446小细胞肺癌细胞系的总RNA及其MDR1基因的影响.方法采用GWGP80型远距离60Co治疗机对进入指数生长期的NCI-H446小细胞肺癌细胞系进行分次外照射,每次2 Gy,总剂量为50 Gy.用Trizol分别提取未照射和已完成全部外照射剂量的NCI-H446细胞系的总RNA.通过RT-PCR,琼脂胶电泳,应用Gelbase电脑软件计算电泳条带的平均光密度值(光密度值愈大,表示产物愈多),求两组细胞的MDR1DNA与其β-actin DNA的平均光密度值的比来确定两组细胞MDR1mRNA表达的高低.结果在相同细胞数和相同体积的条件下,未照射组和照射组细胞总RNA的浓度分别为25.9 μg/ml和16.6 μg/ml;未照射组细胞其MDR1DNA/β-actin DNA为1.078,照射组为1.338.结论对NCI-H446小细胞肺癌细胞系进行外照射可抑制其总RNA的生物合成;同时可提高其MDR1mRNA的表达水平.
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累积高剂量照射对体外培养的小细胞肺癌细胞系的总RNA及其多药耐药基因的影响
观察累积高剂量外照射对小细胞肺癌NCI-H446细胞系的总RNA及其MDR1mRNA的影响.采用GWGP80型远距离60Co治疗机对进入指数生长期的NCI-H446小细胞肺癌细胞系进行分次外照射,每次2Gy,累积总剂量为50Gy.用Trizol分别提取未照射和已完成全部外照射剂量的NCI-H446细胞系的总RNA.通过RT-PCR,琼脂胶电泳,Gelbase电脑软件计算电泳条带的平均OD值(OD值愈大,表示产物愈多),求两组细胞的MDR1 DNA与其β-actin DNA的平均OD值的比来确定两组细胞MDR1mRNA表达的高低.结果显示,在相同细胞数和相同体积的条件下,未照射组和照射组细胞总RNA的浓度分别为25.9μg/ml和16.6μg/ml;未照射组细胞MDR1DNA/β-actin DNA为1.078,照射组为1.338.由此推断MDR1mRNA表达增加.研究表明,对小细胞癌细胞系NCI-H446进行累积高剂量外照射可抑制其总RNA的生物合成;同时可提高其MDR1mRNA的表达水平.提示累积高剂量放射可能诱发多药耐药.
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吗啡对小鼠纹状体细胞外尿嘧啶释放的影响及机制初探
目的:研究吗啡对小鼠纹状体细胞外尿嘧啶释放的影响并探讨相关机制.方法:采用脑内微透析技术结合高效液相紫外检测器检测尿嘧啶含量,紫外分光光度法检测纹状体总RNA含量.结果:与空白对照组相比,吗啡(10,20 mg·kg<'-1>,ip)可显著降低小鼠纹状体尿嘧啶含量且呈现荆量依赖性;盐酸纳洛酮(4 mg·kg<'-1>,ip)自身对小鼠纹状体尿嘧啶的释放无影响,却可以显著回升尿嘧啶含量至基础水平.吗啡(10,20 mg·kg<'-1>,ip)对小鼠纹状体细胞内RNA含量呈下调作用,与对尿嘧啶含量的下调结果一致,呈现剂量依赖性;盐酸纳洛酮(4 mg·kg<'-1>,ip)对小鼠纹状体总RNA含量无明显影响但能拮抗吗啡对总RNA含量的下调作用.结论:吗啡引起小鼠纹状体尿嘧啶释放降低的作用可能与μ受体相关且与细胞内总KNA的含量变化存在相关性.
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Trizol与RNA Fast1000试剂盒提取外周抗凝血总RNA的方法比较
目的 比较传统Trizol法和试剂盒法提取血液中总RNA的效果.方法 我们将100份人体新鲜血液标本随机分为2组,每组各50份,分别用Trizol法和RNA Fast1000试剂盒法两种方法从外周血中提取RNA测定其纯度和完整性,通过两独立样本的t检验统计分析2组OD值比值数据的差异性.结果 试剂盒提取的总RNA的纯度(1.904±0.15)优于传统的Trizol方法(1.727±0.42).结论 与Trizol法相比,试剂盒法具有简便、快速、高纯度等特点,且提取的RNA样品质量较高,可直接用于RT-PCR合成、Northem杂交等分子生物学操作.
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真核表达载体PEGFP-N1-IL-2的构建
目的：构建真核表达载体 PEGFP-N1-IL-2，为其导入真核或原核细胞打下基础。方法颈脱位处死C57BL／6小鼠，无菌摘除脾脏提取总 RNA，经过 RT-PCR 获取IL-2DNA ，与质粒 PEGFP-N1连接，构建真核表达载体PEGFP-N1-IL-2。结果成功提取了C57BL／6小鼠脾组织总RNA，，经过RT -PCR后获取IL-2DNA并成功构建了真核表达载体PEGFP-N1-IL-2，测序结果与 Genebank 中小鼠 IL-2cDNA （ K02292）序列完全一致。结论真核表达载体PEGFP-N1-IL-2的成功构建，为进一步研究其在原核或真核细胞中表达做好准备。
关键词： 总RNA IL-2 DNA 载体PEGFP-N1-IL-2 -
人肝癌细胞总RNA电转染树突状细胞的体外肿瘤杀伤实验
目的:探讨人肝癌细胞总RNA电转染人树突状细胞(Dendritic Cells,DCs)后诱导特异性效应T细胞及其效应T细胞抗肝癌的特异性.方法:通过密度梯度离心法分离人外周血单核细胞,采用细胞因子体外培养诱导其成为未成熟树突状细胞(Immature Dendritic Cell,imDC)和成熟树突状细胞(Mature Dendritic Cell,mDC).培养肝癌细胞,Trizol一步法提取人肝癌细胞总RNA.通过电转染法将人肝癌细胞总RNA导入imDC内;观测电转染的转染率;采用免疫细胞化学检测电转染前后的imDC形态及其表面标志;通过混合淋巴细胞实验,获取mDC激活的特异性效应T细胞.用MTT法测定效应T细胞的抗肝癌特异性.结果:电转染方法可将人肝癌细胞总RNA导入imDC.电转染前后imDC分子表达无显著差异,mDC的分子表达与imDC相比发生了变化.转染了人肝癌细胞总RNA的mDC可特异的激活T细胞为效应T细胞.效应T细胞可特异性的杀伤人肝癌细胞,而对不相关的MG-63细胞无特异性的杀伤作用.结论:电转染不影响imDC的形态和原有的蛋白表达;转染了人肝癌细胞总RNA的mDC可特异的激活T细胞为效应T细胞;效应T细胞具有抗人肝癌细胞的特异性.
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家兔脂肪组织总RNA提取方法的比较
目的 对2种常用的脂肪组织总RNA提取方法进行比较,优选出脂肪组织提取的方法.方法 取家兔新鲜脂肪组织,分别用2种不同的方法提取总RNA:1.离心柱法:用UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒处理脂肪组织.2.Trizol法:利用传统Trizol法手提总RNA.提取后对2种不同的方法提取的总RNA进行比较.结果 传统Trizol法提取的总RNA的纯度及完整性均较高,优于离心柱法.Trizol法和UNIQ-10离心柱法提取的总RNA分别取3个样品进行测定,其A260/A280的平均值分别为1.598和1.562.结论 用Trizol法提取的脂肪组织总RNA效果较好,优于离心柱法.
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高效快速提取股骨头中总RNA的方法
背景:从骨组织中有效提取总RNA是进行骨科相关实验的基础,目前所知方法的提取效果不理想.目的:探寻一种高效、快速的骨组织总RNA提取方法.方法:取健康大耳白兔股骨头迅速置于用液氮预冷过的研钵中,液氮中反复研磨至粉末状,再将其移至预冷的匀浆器内,加入Trizol,充分匀浆后4 ℃离心,取上清,加入氯仿离心,使RNA与细胞DNA、蛋白质及其他成分分离从而得到总RNA.另取兔股骨头,按传统方法取材后保存,无匀浆过程,传统Trizol法提取总RNA作为对照.紫外分光光度计测定RNA样品浓度、纯度及产率.甲醛变性胶电泳观察RNA的28 S,18 S条带是否清晰,有无降解和DNA污染.结果与结论:实验方法提取的总RNA浓度在0.80～0.90 g/L,A260/A280在1.90～2.00之间,A260/A230在1.4～1.6之间,明显高于传统方法提取的RNA各指标,说明实验方法提取的总RNA纯度高,无DNA、蛋白质污染.甲醛变性胶电泳可清晰显示28 S,18 S两条带,大体观察其比例大约为1∶1,证实RNA提取完整,没有降解.由此可见,实验方法提取的骨组织总RNA质量高,提取方法方便、快捷,可用于骨组织分子生物学研究.
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一种简捷提取植物总RNA的方法
植物总RNA的提取历来是分子生物学实验中的重点及难点.在实验中,我们找到了一种改进的提取植物总RNA的方法.该方法不仅简单、快捷,而且经济、方便,尤其适用于RNA提取困难的豆科植物.
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K562细胞总RNA转染对人树突状细胞抗原提呈、成熟及功能影响的初步研究
探讨人的树突状细胞(dendritic cell,DC)体外经K562细胞株总RNA转染后,能否诱导出p210蛋白表达,并诱导特异性CTL,为DC疫苗的临床应用提供理论基础.自健康人浓缩白细胞制剂分离有黏附特性的单核细胞,经GM-CSF、IL-4培养5 d后,获得未成熟的DC(imDC);体外以脂质体DOTAP或直接电穿孔转染K562细胞总RNA.抽提后即时以及转染24 h后的DC内RNA进行RT-PCR检测,Western blot分析p210蛋白表达,流式细胞仪检测,以及诱导CTL杀伤K562细胞功能检测等.结果显示,RT-PCR检测表明:DC经K562细胞总RNA转染后,细胞内出现Bcr-Abl的cDNA条带,24 h后消失.Western blot实验表明:转染24 h后,开始表达p210特征性蛋白.与对照组相比,转染K562细胞总RNA的DC,在24 h后CD80、CD83、CD86、HLA-DR等表面标志均不同程度表达增高,并可促进T细胞对K562的杀伤活性.该研究从多方面角度说明应用肿瘤总RNA负载DC来制备DC疫苗的可行性,提示改良的DC疫苗抗肿瘤可能的应用前景.
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肝细胞癌变过程中维生素E水平改变及其作用机制研究
目的探讨维生素E(VitE)水平在肝细胞癌变过程中的改变与作用机制.方法用2-FAA制备大鼠肝癌动物模型,在肝细胞癌变过程中观察其肝组织学、肝总RNA水平及血清VitE含量的动态改变,并对不同肝病患者血清中VitE的浓度进行了分析.结果在肝细胞癌变过程中,鼠血清中VitE含量呈逐渐降低,而鼠肝总RNA水平逐渐增加趋势;在急性肝炎、慢性肝炎、肝硬变和肝癌患者血清中VitE含量均显著低于正常对照(P＜0.05),而肝癌组血清VitE水平显著低于急性肝炎、慢性肝炎和肝硬变组(P＜0.001).结论肝脏癌变过程中VitE量显著减少而总RNA水平显著升高,这种改变可能与体内氧化/氧化系统失衡有关.
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银屑病皮损的总RNA含量分析及甲基绿-派诺宁染色研究
测定20份各期银屑病皮损标本的总RNA水平,并采用甲基绿-派诺宁染色对TUNEL阳性切片进行染色.结果显示银屑病皮损中总RNA水平(772.50±345.21μg/g)比正常皮肤(341.25±30.76μg/g)高,又以进行期高(1050±300μg/g).银屑病皮损的甲基绿-派诺宁染色显示表皮全层角质形成细胞均呈绿核红浆着染,TUNEL染色阳性细胞也不例外.表明银屑病皮损内有高水平的基因转录.进行期活跃;TUNEL阳性角质形成细胞是凋亡细胞.
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浙贝母鳞茎总RNA提取方法研究及质量评价
筛选出适合提取浙贝母鳞茎总RNA的方法,为浙贝母功能基因分析奠定良好的基础.采用TRIzon法、TIANGEN DP432、OMEGA R6827和全式金ER501等4种试剂盒法提取浙贝母鳞茎总RNA,并通过分光光度计、琼脂糖凝胶电泳、RT-PCR及qPCR法对这4种方法提取的总RNA的质量进行评价.4种方法均能提取出总RNA,其中TRIzon法提取的总RNA杂质含量较高;以其为模版进行RT-PCR分析时均可得到清晰的单一目的条带;基因表达分析显示,HMGR基因表达量OMEGA R6827＞ TRIzon法＞TIANGEN DP432＞全式金ER501,说明OMEGA R6827试剂盒提取的总RNA较为完整,降解程度低.TIANGEN DP432、OMEGA R6827和全式金ER501均适宜于提取浙贝母鳞茎总RNA,且适用于RT-PCR实验,但进行基因表达分析时,OMEGA R6827试剂盒较为合适.
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浙贝母鳞茎总RNA提取方法的研究
建立适合功能基因分析的浙贝母Fritillaria thunbergii Miq.鳞茎总RNA的提取方法,将为后续与药效成分相关功能基因的分析奠定良好的工作基础.本研究通过紫外分光光度法、非变性琼脂糖电泳法以及DDRT-PCR方法比较异硫氰酸胍法、改良的异硫氰酸胍法、改良的SDS法和改良CTAB法提取浙贝母鳞茎总RNA的质量.结果表明,通过改良的CTAB法提取出的总RNA的完整性好(28 s/18 s约为2),纯度高(其A260/A280和A260/A230分别为1.95和2.30),以其为模板进行DDRT-PCR分析时能获得清晰的差异条带.通过本研究建立的改良CTAB法可于浙贝母鳞茎总RNA的提取,并可为其它植物鳞茎的总RNA提取提供参考.
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肺癌组织中神经元特异性烯醇化酶和总RNA的表达与改变
目的：探讨神经元特异性烯醇化酶（NSE）在肺癌中的表达及其诊断价值。 方法：收集人肺癌，癌周及远癌组织各30份，制备和定量总RNA水平，并在 肺癌组织匀浆后，分析组织中NSE的浓度变化。结果：肺癌组织NSE表达显 著高于癌周及远癌组织（P<0.01 ），并与总RNA浓度成正相关（r[ WTBZ]=0.04，P<0.01），各种肺癌组织中NSE及RNA浓度无显著性差异。结论：提示肺癌组织核酸代谢旺盛，分析过度表达的NSE有助于肺癌的早期诊断 。
关键词： 肺癌 神经元特异性烯醇化酶 总RNA 表达 -
一种高效同时提取微量组织中总RNA、DNA和蛋白的技术方法的改进
目的 改进传统Trizol法,以至能从微量组织样品中提取高质量RNA并同时提取基因组DNA和总蛋白.方法 用改良后的Trizol法提取小鼠肝脏组织总RNA、基因组DNA以及总蛋白,并与传统Trizol法提取总RNA、商业化试剂盒提取基因组DNA和RIPA裂解Buffer提取总蛋白的方法进行比较.结果 改良Trizol法提取小鼠肝组织RNA的得率为3.64μg/mg,传统Trizol法为1.95μg/mg,平均D260/280比值为2.1和2.01;改良Trizol法能够得到比传统Trizol法更完整的RNA,琼脂糖电泳图谱中28S/18S的比值更接近2∶1.改良Trizol法与商业试剂盒相比,提取所得的基因组DNA尽管在得率上有较明显差距,分别为0.49μg/mg和1.78μg/mg,但仍保持较好的纯度.改良Trizol法提取所得蛋白的平均得率为RIPA Buffer裂解法的50％～60％,经过SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色法验证,并无明显蛋白丢失.结论 改良Trizol法可以同时提取组织的总DNA、RNA与总蛋白,相比传统Trizol法提取总RNA更高效、质量更优;相比商业化试剂盒提取基因组DNA更快捷、更经济;相比RIPA Buffer裂解法提取总蛋白在小分子蛋白的保留中更好.
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华支睾吸虫成虫总RNA的一步法提取与纯化
目的为华支睾吸虫cDNA文库的构建提供基础.方法采用硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取华支睾吸虫成虫总RNA.结果与结论 3.5h左右可自华支睾吸虫成虫获得高纯度、完整性好的RNA.其总RNA存在体内缺口现象,28s电泳主带缺如.
