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5-HTR2C重组质粒电转染至大鼠海马神经元对细胞活性的影响
目的:5-羟色胺2C受体在抑郁症的发病及治疗机制中发挥重要的作用,模拟5-HTR2C表达的异常升高,建立5-HTR2C高表达的细胞模型,为抑郁症治疗药物的开发提供平台.方法:采用课题组前期已构建5-HTR2C真核表达载体;按试剂盒方法提取5-HTR2C重组质粒;并取新生24 h内Wistar乳鼠海马,制备海马神经元,按试剂盒方法对质粒进行电转染,并于荧光显微镜下观察转染效果;将所培养细胞分为:非转染细胞(NTC)和转染细胞(TC),转染细胞分为:转染组(TC+5-HTR2C质粒)、空质粒组(TC+空质粒)、激动剂组(TC +激动剂);为确定激动剂组细胞提取蛋白的时间,分别于加入激动剂后0、5、10、20、40、60 min提取蛋白,Western- blot检测;待各组细胞处理后,采用Western-blot检测5-HTR2C以及MEK/P-MEK的表达,以验证5-HTR2C重组质粒转染后是否仍有活性.结果:海马神经元电转染后48 h后,神经元数量较多,电转染率及生存率高;体外培养的海马神经元中加入激动剂mCPP后5 min至60 min, MEK磷酸化水平逐渐升高,在20 min时MEK磷酸化水平已较高;与NTC相比,TC+5-HTR2C质粒和TC +激动剂组中P-MEK的蛋白水平明显升高.结论:5-HTR2C重组质粒导入海马神经元后48 h细胞生长良好,死亡率低,细胞饱满,电转染率较高,可于此时收集细胞.激动剂组可在mCPP与细胞共培养后20-60 min间收集细胞.通过比较TC+5-HTR2C质粒组及TC +激动剂组,发现加入激动剂的细胞中MEK磷酸化水平较前者要强.因此,5-HTR2C重组质粒转染至海马神经元中后仍具有生理活性,说明5-HTR2C重组质粒的转染比较成功.
关键词： 5-HTR2C重组质粒 电转染 大鼠海马神经元 抑郁症 -
草鱼肾细胞电转条件的优化及草鱼呼肠孤病毒NS26蛋白的瞬时表达
本研究先以pEGFP-N1载体质粒中的绿色荧光蛋白基因为报道基因进行电转实验,优化电压、脉冲时间、质粒添加量和电击次数等电转条件,确立佳条件.实验表明,细胞密度为1.5×107/mL时,取200 μl在0.2 cm电击杯中进行电击转染,电压为200 V,脉冲时间为45 ms,添加质粒30 μg,电击1次时,转染效果佳.提取草鱼呼肠孤病毒基因组总RNA,以其逆转录的cDNA作为扩增模板,设计特异引物扩增出GCRV非结构蛋白NS26的基因片段,重组到pEGFP-N1载体上得到重组质粒pEGFP-NS26,将其导入CIK细胞中用电转法高效表达了EGFP-NS26融合蛋白.本研究为进一步研究NS26的功能奠定了基础.
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人肝癌细胞RNA电转染至未成熟树突状细胞的扫描电镜观察
目的 观察电转染人肝癌细胞RNA前后未成熟树突状细胞(imDCs)的表面形态学变化.方法 取人外周血,纯化获取单核细胞后诱导其成为imDCs,然后通过电转染方法将人肝癌细胞RNA导入其内;用7种特异性抗体的免疫细胞化学技术对电转染前后的树突状细胞鉴定后,进行扫描电镜观察.结果 电转染人肝癌细胞RNA后imDCs内TERT表达显著增加,其他分子表达无显著改变.电转染前,imDCs多呈圆形、椭圆形或不规则形,体积较单核细胞大,但大小不均,在细胞表面可见长短不一的微绒毛,或/许多泡状、面纱状或云朵状细胞突起;电转染后,可在imDCs表面见到由于电转染所造成的孔,并有一定数量的细胞融合和细胞死亡,但绝大多数细胞可恢复至正常结构状态.结论 电转染打孔可为外源物质(如肝癌细胞RNA或其他肿瘤细胞RNA)导人细胞内提供可行性,并为进一步利用imDCs制作肿瘤疫苗,开展肿瘤的生物治疗提供一种可行方案.
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树突状细胞电转染的优化条件及影响因素
目的 探讨树突状细胞(DC)电转染的方法、优化条件以及影响DC电转染率和存活率的主要因素.方法 提取人肝癌细胞(Bel 7402) RNA,利用淋巴细胞分离液密度梯度法分离人外周血单个核细胞(PBMC),并通过贴壁法获取单核细胞作为树突状细胞前体(pDC).将pDC置含rhGM-CSF和rIL-4的RPMI-1640培养液内联合培养诱导7d,使之充分分化为未成熟的DC (imDC).应用电穿孔仪(electroporation apparatus)分别将人肝癌细胞总RNA和绿色荧光蛋白(GFP)电转染至imDC,并设定不同的电压、脉冲时间、细胞浓度、温度和电转染缓冲液等条件.荧光镜下和光镜下分别计算绿色荧光阳性细胞数和总细胞数.电转染1d后,用0.4%锥虫蓝染色分别计算其电转染率和存活率.结果 当imDC浓度为5×106/ml与40μg的人肝癌细胞总RNA混合,设定电转染仪电压为300V、脉冲时间为500μs时,其电转染率达到高值,imDC存活率约49.07%.结论 电转染提供了一种使人肝癌细胞RNA电转染至imDC的可行技术.影响imDC电转染率的主要因素是受体细胞imDC的生长状况、电转染的电压及脉冲时间.
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结核 DNA 疫苗肌肉注射加电转染不同免疫方案免疫效果的研究
目的：研究结核DNA疫苗肌肉注射加电转染不同免疫方案的免疫效果，获得DNA疫苗肌肉注射加电转染免疫的佳方案。方法40只BALB/c小鼠随机分为4组：（1）生理盐水组。（2）50μg Ag85A DNA组。（3）100μg Ag85A DNA组。上述3组分别肌肉注射加电转染免疫3次。（4）混合Ag85A DNA免疫组，第1和3次各肌肉注射加电转染10μg Ag85A DNA，第2次肌肉注射加电转染100μg Ag85A DNA，每2周免疫1次。后1次免疫后2周、6周每组各杀5只小鼠，用ELISA方法检测小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4水平；用流式细胞术检测小鼠全血单个核细胞分泌IFN-γ的Th1细胞和分泌IL-4的Th2细胞比值；用定量RT-PCR检测小鼠肌肉电转染部位Ag85A DNA的含量。用ELISA方法检测小鼠免疫前、第1～3次免疫后10 d小鼠血清特异性抗体水平。结果免疫结束后2周，小鼠脾淋巴细胞产生IFN-γ水平：混合Ag85 A DNA免疫组[（703．66±394．74） pg/ml]和50μg Ag85A DNA组[（648．60±439．41） pg/ml]明显高于生理盐水组[（70．58±108．76） pg/ml]（t值分别为3．975、3．629，P值分别为0．0004、0．0010）和100μg Ag85A DNA组[（86．08±135．73） pg/ml]（t值分别为3．878、3．532，P值分别为0．0005、0．0013），但混合Ag85A DNA免疫组和50μg Ag85A DNA组之间差异无统计学意义（t＝0．3457，P＝0．7318）；全血单个核细胞内Th1/Th2细胞比值：混合Ag85A DNA免疫组（3．82±1．09）均显著高于生理盐水组（0．37±0．11）、50μg Ag85A DNA组（1．20±0．80）、100μg Ag85A DNA组（1．10±0．60）（t值分别为2．980、2．260、2．352，P值分别为0．0058、0．0315、0．0257）；肌肉注射加电转染部位 Ag85A DNA 含量：100μg Ag85A DNA 组[（963．40±892．79）拷贝]显著高于50μg Ag85 A DNA组[（270．90±398．18）拷贝]和混合Ag85 A DNA免疫组[（205．80±136．95）拷贝]（t值分别为2．639、2．887，P值分别为0．0144、0．0081）。免疫结束后6周，小鼠脾淋巴细胞产生IFN-γ水平：混合Ag85A DNA免疫组[（238．43±258．90）pg/ml）]高于生理盐水组[（0±0） pg/ml]、50μg Ag85A DNA组[（83．14±135．08） pg/ml]和100μg Ag85A DNA组[（163．83±207．13） pg/ml]，但各组之间差异均无统计学意义（t值分别为1．4970、0．9750、0．4684，P值分别为0．1442、0．3369、0．6427）；全血单个核细胞内Th1/Th2细胞比值：混合Ag85A DNA免疫组（4．67±5．05）显著高于生理盐水组（0．77±0．19）、50μg Ag85A DNA组（1．23±0．74）和100μg Ag85A DNA组（0．51±0．49）（t值分别为3．199、2．971、3．610，P值分别为0．0033、0．0059、0．0011）；肌肉电转染部位Ag85A DNA含量各组之间差异均无统计学意义。第2次免疫后，50μg Ag85A DNA组、100μg Ag85A DNA组和混合Ag85A DNA免疫组血清抗Ag85A特异性IgG抗体均比第1次免疫后显著升高（F＝7．17，P＝0．0111），但3组之间差异无统计学意义。第3次免疫后，100μg Ag85A DNA组和混合Ag85A DNA免疫组血清抗Ag85A特异性IgG抗体比第2次免疫后略有升高，而50μg Ag85 A DNA组略有降低，但3组之间差异无统计学意义。结论电转染可以使低剂量的DNA 疫苗产生较好的免疫效果，低、高剂量混合免疫是DNA疫苗肌肉注射加电转染免疫的佳方案。
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pMAGE-Al/EGFP转染的人树突状细胞体外诱导特异性抗肿瘤免疫效应的研究
树突状细胞(DC)是目前已知功能强的抗原提呈细胞,被广泛应用于研制各种肿瘤疫苗[1].肿瘤特异性抗原MAGE-Al在不同来源肿瘤组织中有较高表达[2],因而在肿瘤免疫治疗中一直备受重视.本实验中我们构建了重组真核表达载体pMAGE-Al/EGFP,体外电转染人人外周血单核细胞来源DC,并评价其体外诱导特异性抗肿瘤免疫的能力,以期为临床开展MAGE-Al为基础的免疫治疗提供有利的分子生物学工具.
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SEA和喉癌MAGE-A3构建的真核质粒pMAGEA3-IRES-SEA经过电穿孔转染在小鼠体内的转录
目的：检测真核质粒pMAGEA3-IRES-SEA经过电穿孔转染在小鼠中的转录。方法将葡萄球菌肠毒素A（staphylococcal endotoxin A，SEA）和喉癌来源的黑色素瘤抗原A3（melanoma-associated antigen A3， MAGE-A3），构建成基因共表达的真核质粒 pMAGEA3-IRES-SEA。将pMAGEA3-IRES-SEA用电转染的方法免疫BALB/C小鼠单侧股四头肌，每2周1次，每次注射50μg，共免疫3次。末次免疫2周后，取注射部位组织，用荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测目的基因在注射部位肌肉中的转录情况。结果在实验小鼠注射部位的骨骼肌内检测到 SEA、MAGE-A3基因转录mRNA。结论所构建的pMAGEA3-IRES-SEA真核表达质粒，可通过电转染的方式，在小鼠体内能有效地转录。这为研究该质粒通过小鼠的体内转录蛋白的表达，诱导机体细胞免疫、体液免疫来清除喉癌，奠定了理论基础。
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麝香水溶物对大鼠神经干细胞的生长、分化和电转染率的影响
目的:研究麝香水溶物对培养的大鼠神经干细胞的生长、分化和电转染率的影响.方法:在培养基中加入不同浓度的麝香水溶性提取物后,观察大鼠神经干细胞的生长分化情况;利用表达增强型绿色荧光蛋白的质粒pEGFP-Cl,对麝香水溶物处理的神经干细胞进行电穿孔转染,调查电转染率.结果:麝香水溶物处理后的大鼠神经干细胞的细胞团分散,神经突起增多、变长,贴壁细胞增加,细胞形态呈多样性.在0.3‰浓度下,神经干细胞有向神经胶质样细胞分化的趋势.对于麝香处理后变化的细胞,再转到正常培养基中后,细胞基本都能恢复到正常的神经干细胞形态,浓度较高(3‰)时,细胞的恢复能力下降,部分细胞因细胞膜受损严重而死亡.电转染结果表明,麝香处理后发生变化的细胞对pEGFP-Cl的电转染率明显提高.结论:麝香水溶物能促进大鼠神经干细胞团的分散和细胞贴壁、变形,并有向神经胶质样细胞分化的趋势.同时可以提高神经干细胞对pEGFP-Cl的电转染率.
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人肝癌细胞总RNA电转染树突状细胞的体外肿瘤杀伤实验
目的:探讨人肝癌细胞总RNA电转染人树突状细胞(Dendritic Cells,DCs)后诱导特异性效应T细胞及其效应T细胞抗肝癌的特异性.方法:通过密度梯度离心法分离人外周血单核细胞,采用细胞因子体外培养诱导其成为未成熟树突状细胞(Immature Dendritic Cell,imDC)和成熟树突状细胞(Mature Dendritic Cell,mDC).培养肝癌细胞,Trizol一步法提取人肝癌细胞总RNA.通过电转染法将人肝癌细胞总RNA导入imDC内;观测电转染的转染率;采用免疫细胞化学检测电转染前后的imDC形态及其表面标志;通过混合淋巴细胞实验,获取mDC激活的特异性效应T细胞.用MTT法测定效应T细胞的抗肝癌特异性.结果:电转染方法可将人肝癌细胞总RNA导入imDC.电转染前后imDC分子表达无显著差异,mDC的分子表达与imDC相比发生了变化.转染了人肝癌细胞总RNA的mDC可特异的激活T细胞为效应T细胞.效应T细胞可特异性的杀伤人肝癌细胞,而对不相关的MG-63细胞无特异性的杀伤作用.结论:电转染不影响imDC的形态和原有的蛋白表达;转染了人肝癌细胞总RNA的mDC可特异的激活T细胞为效应T细胞;效应T细胞具有抗人肝癌细胞的特异性.
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人端粒酶反转录酶基因电转染优化培养大鼠前软骨干细胞
背景：将人端粒酶反转录酶转染至目的细胞中，可以提高其端粒酶活性，保持端粒的长度，在调控增殖和分化方面有重要作用。
目的：探讨人端粒酶反转录酶基因转染对体外培养大鼠前软骨干细胞端粒酶活性及生物学特性的影响。
方法：体外培养Wistar大鼠前软骨干细胞，以反转录病毒PLXSN 为载体介导人端粒酶反转录酶基因转染，同时设置对照组、阴性对照序列组、转染组。用TRAP-ELISA法检测前软骨干细胞端粒酶活性， RT-PCR、Western blot检测前软骨干细胞人端粒酶反转录酶基因和蛋白的表达，CCK-8法、细胞生长曲线检测细胞生长增殖情况，流式细胞仪测定细胞周期分布的变化。
结果与结论：①人端粒酶反转录酶基因转染前软骨干细胞48 h，端粒酶活性明显升高；②与对照组、阴性对照序列组相比，转染组人端粒酶反转录酶基因和蛋白水平表达明显，细胞的生长速度明显增快， G0/G1期细胞数减少，S期细胞数增多，差异有显著性意义(P<0.05)；③结果表明，以反转录病毒PLXSN为载体介导人端粒酶反转录酶基因转染使前软骨干细胞端粒酶活性明显升高，能够促进大鼠前软骨干细胞增殖。 -
电穿孔法转染脐带华通胶间充质干细胞的佳条件
背景:脐带华通胶间充质干细胞是目前较为原始的干细胞,为当前干细胞的研究热点之一,是基因治疗的理想载体.然而,目前尚未有对脐带华通胶间充质干细胞电转染条件的研究,因此探索脐带华通胶间充质干细胞的电转染佳条件占据重要地位.目的:探讨不同电穿孔条件对脐带华通胶间充质干细胞转染率的影响,以确定佳电转染条件.方法:通过控制电压、脉冲时长及细胞状态等转染条件,采用不同条件组合后用电穿孔法将质粒EEV-EGFP转入脐带华通胶间充质干细胞,流式细胞仪检测转染率.结果与结论:①电压自125 V至150 V,转染率呈现递增趋势,150 V时获得大转染率,但将电压进一步调高至170 V,转染率开始显著降低;②脉冲时长为5.0 ms时获得大转染率;脉冲时长为2.5 ms和7.5 ms时转染效率均有所降低;③与低氧培养比较,正常培养的细胞转染率更高;④结果表明,正常培养的脐带华通胶间充质干细胞在电压150 V、脉冲时长5.0 ms、脉冲间隔时间50 ms、脉冲数2次时可达到较高的电转染率.
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稳定表达CD200的U937细胞株的建立
目的:构建稳定表达CD200蛋白的人单核细胞系U937细胞株,为研究该基因的作用机制奠定基础.方法:用电转染基因法将含有人CD200 cDNA的真核表达载体pcDNA3-CD200质粒和pcDNA3质粒分别转入人单核细胞系U937细胞中,经G418筛选,转染阳性细胞连续传代培养,并应用RT-PCR及流式细胞术检测CD200 mRNA和蛋白表达情况.结果:经G418筛选,U937细胞全部死亡,转染pcDNA3质粒和pcDNA3-CD200重组质粒的U937细胞存活,并可连续传代培养30代;转染pcDNA3-CD200重组质粒的U937细胞RT-PCR检测有一特异性扩增带;流式细胞术检测CD200表达结果显示:转染pcDNA3-CD200重组质粒的U937细胞CD200表达阳性细胞率(77.20%)显著高于转染pcDNA3质粒(3.20%)和U937细胞组(2.10%)(F=133 996.40,P＜0.01);各代间差异无显著性(F=1.03,P＞0.05).结论:用基因转染法成功地建立了稳定表达CD200蛋白的人单核细胞株U937-pcDNA3-CD200.
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C57小鼠淋巴细胞瘤电转染GM-CSF基因研究
目的:制备高表达GM-CSF的C57小鼠T淋巴瘤细胞系.方法:将小鼠GM-CSF真核表达质粒用电穿孔方法导入C57小鼠T淋巴瘤细胞中,倍比稀释法制备单个细胞克隆,经RT-PCR、骨髓干细胞增殖实验和集落形成实验筛选相对高表达GM-CSF的RMA-GM克隆.结果:获得了高表达GM-CSF的RMA细胞系RMA-GM,其出瘤时间延长.结论:C57小鼠RMA-GM克隆细胞出瘤时间延长,肿瘤细胞免疫原性增强.
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CHO DG44细胞电转染条件的优化
目的 优化CHO DG44细胞的电转染条件,提高细胞的转染效率.方法 采用电转染的方法将pEGFP-1质粒转入CHO DG44细胞内,利用L9(33)正交试验设计,对质粒量、电压和电容3因素进行优化,流式细胞仪检测不同条件下的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)阳性率和GFP的平均荧光强度,台盼蓝染色对细胞进行计数,了解细胞生长情况.结果 3个因素中,电压对转染效率影响大,其次为电容,质粒浓度影响小.质粒量8 μg、电压300 V、电容900 μF为佳电转染条件.结论 优化了CHO DG44细胞的电转染条件,为外源基因转染CHO DG44细胞表达重组蛋白提供了基础数据.
关键词： 电转染 CHO DG44细胞 正交试验设计 转染效率 -
活化/抑制CD59对T淋巴细胞增殖的影响
目的:研究活化/抑制CD59分子对T细胞增殖的影响.方法:Jurkat细胞分别电转入pSUPER-siCD59质粒及用CD59活化抗体刺激.激光共聚焦显微镜下观察细胞的电转情况及CD59分子在细胞膜上的分布及表达;MTT比色法检测细胞的增殖.Western blot检测CD59分子表达及T细胞活化相关蛋白ZAP70磷酸化水平.结果:激光共聚焦显微镜下可见电转染细胞表达绿色荧光,转染效率约为40％.转染pSUPER-siCD59质粒后CD59荧光强度强度降低,CD59分子均匀分布于细胞膜与正常Jurkat细胞分布一致.抗体活化后CD59在细胞膜成簇状分布.抗体活后细胞增殖速率和磷酸化ZAP70的蛋白表达水平均高于正常组(P＜0.05),而细胞电转质粒后则恰恰相反.结论:CD59通过与信号转导分子的相互作用促进T细胞活化增殖.
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GFP质粒电转染SGC7901/ADM细胞的研究
目的 以电穿孔法,将GFP质粒转染SGC7901/ADM细胞,优化转染条件以得到较高的转染率.方法 在400μl电转染体系中,以不同的电场强度(150V、180V、210V和240V),脉冲时间(5ms、25ms、50ms和75ms),电场强度和脉冲时间(150V,75ms;180V,50ms;210V,25ms;240V,5ms),分别将GFP质粒电转染SGC7901/ADM细胞,并检测不同条件下细胞的存活率和转染率.结果 180V/50ms和210V/25ms的条件下,均能取得较好的电转染效果.
关键词： 电转染 SGC7901/ADM细胞 GFP质粒 -
电转染技术促进人胚肺二倍体成纤维细胞的衰老进程
目的 观察NucleofectorTM电转染技术对人胚肺二倍体成纤维细胞(MRC-5)衰老进程的影响.方法 取年轻代数的MRC-5细胞(30代),分为3组,第1组为正常培养对照组,第2组为未加质粒电转对照组,第3组为空质粒EGFP-N1电转组.采用NucleofectorTM电转仪配合试剂盒用U-023程序进行电转,计算细胞衰老相关SA-β-半乳糖苷酶(gal)阳性率,分别采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹法分别测定p16 mRNA、P16蛋白的表达.结果 ①第1组的SA-β-gal阳性率为(9.01±0.65)%,显著低于第2组的(32.00±0.31)%和第3组的(31.13±1.62)%(P值均<0.01),后两组间的差异无统计学意义(P0.05).②第2组、第3组的p16 mRNA、P16蛋白均显著高于第1组(P值均<0.05),第2组与第3组间的差异无统计学意义(P值均0.05).结论 NucleofectorTM电转方法 可促进人MRC-5的衰老,此作用可能是通过上调P16蛋白的表达来实现的.
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一种优化的成年斑马鱼视网膜吗啡啉电转染方法
通过吗啡啉(morpholino,MO)电转染敲降斑马鱼视网膜内目标基因表达是研究基因功能的有效手段,但现有方法存在局限性.本文旨在发展一种优化的成年斑马鱼视网膜MO电转染方法.优化要点是在电极内侧涂抹超声凝胶,并使用方形电极而不是圆形电极.结果显示,使用超声凝胶可有效减少电转染所致视网膜损伤并简化实验步骤,采用方形电极显著提高了MO电转染效率.用本方法敲降视网膜再生相关基因Ascl1a显著抑制了视网膜祖细胞的生成.本方法是对现有MO电转染方法的优化.
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戊型肝炎病毒ORF3基因转染HeLa细胞及其稳定表达
目的 将戊型肝炎病毒ORF3基因转染HeLa细胞,建立能稳定表达ORF3蛋白(pORF3)的细胞株.方法 将ORF3基因片段克隆至真核表达质粒pcDNA3,构建重组质粒pcDNA3-ORF3.电穿孔法将其导入HeLa细胞中,G418筛选得到稳定抗性的细胞株,并用RT-PCR和Western印迹法分别从mRNA水平和蛋白水平检测ORF3的表达.结果 成功构建了重组表达质粒pcDNA3-ORF3,并筛选获得能稳定表达pORF3蛋白的HeLa细胞株.结论 pORF3蛋白能够在HeLa细胞中稳定表达,为进一步研究其生物学功能奠定了实验基础.
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TGF-β1和 EGFP 体外电转染兔骨髓间充质干细胞的实验研究
目的：通过电转染介导转化生长因子β1(TGF-β1)转染兔骨髓间充质干细胞(BMSCs),观察Ⅱ型胶原表达的情况。方法用全骨髓细胞贴壁培养法分离、培养兔 BMSCs；诱导14 d 后,免疫组化和 Western blot 法检测Ⅱ型胶原表达。结果 BMSCs CD90表达阳性,CD31表达阴性；成功转染 TGF-β1至 BMSCs；通过免疫组化及 Western blot 法检测TGF-β1组细胞内Ⅱ型胶原有较强的表达,与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)组和空白对照组相比差异有统计学意义(P<0．05)。结论电转 TGF-β1质粒至兔 BMSCs,可以促进Ⅱ型胶原表达。
