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桑寄生不同部位总RNA提取方法比较研究
目的:从桑寄生中提取高质量的RNA.方法:以桑寄生叶片、茎、花和种子为材料,采用TRIzol试剂盒法、改良TRIzol法、CTAB-LiCl法、CTAB-异丙醇法4种方法,比较不同材料及不同方法分离RNA的效果.结果:TRIzol试剂盒法和改良TRIzol法均不能有效的去除桑寄生中的多糖和蛋白质等杂质,不适合用于桑寄生RNA的提取;CTAB-LiCl法提取的RNA质量较高、完整性较好,可满足各种后续分子生物学实验的要求;CTAB-异丙醇法提取桑寄生RNA的效果虽然较好,但还达不到小RNA分析实验要求.结论:为桑寄生后续分子生物学研究提供基础,也为次生代谢物较丰富的药用植物RNA的提取提供参考.
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一种适用于不同发育期山楂果实总RNA提取的方法
目的:筛选从不同发育期山楂果实中提取RNA的佳方法.方法:对不同发育期山楂果实总RNA提取方法进行了探索,考察了Trizol法、改良Trizol法、经典十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法和改良CTAB法提取RNA的效果,采用琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白定量仪检测RNA质量.结果:Trizol法、改良Trizol法对成熟期山楂果实RNA提取效果不佳,琼脂糖凝胶电泳检测几乎看不到条带;经典CTAB法对各发育期样本RNA提取质量均不理想;改良CTAB法对不同发育期山楂果实总RNA有良好的提取效果,A260nm/A280nm均在2.0左右,28 S和18S条带完整,满足反转录和聚合酶链式反应(PCR)扩增反应的需求.结论:建立的改良CTAB法是一种有效的山楂果实总RNA提取方法,适用于不同发育期山楂果实RNA的提取,为开展山楂有效成分的生物合成研究奠定了基础.
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单层培养细胞总RNA两种提取方法的比较
目的 探讨单层培养细胞总RNA提取过程中先行细胞消化或离心富集对所提RNA质量是否产生影响.方法 培养NGF诱导的PC12细胞,采用Trizol试剂提取RNA:离心组(A)先将贴壁生长细胞经胰酶消化、离心获得细胞沉淀,加入l ml Trizol进行RNA提取;直接组(B)将培养液弃尽后直接加入Trizol试剂(1 ml/10 cm2瓶壁)进行RNA提取;均采用琼脂糖凝胶电泳分析RNA完整性,紫外分光光度仪测定RNA浓度和OD260/OD280比值.结果 凝胶电泳结果显示,直接组出现3条清晰的条带(28S、18S和5S条带),离心纽在电泳末端5S区出现粗大的条带.两组OD260/OD28比值相似,约为1.6.直接组组间样品间RNA浓度相差较大.结论 采用离心法和直接法提取贴壁细胞总RNA,先行细胞离心富集增加了RNA降解机会,直接法提取的RNA质量较高,考虑对后续实验的影响,直接法更优于离心法.
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3种RNA提取方法在血清丙型肝炎病毒RNA定量检测中的性能评价
目的 比较3种方法对血清HCV RNA的提取性能,并对其作方法学评价,揭示RNA提取技术对HCVRNA定量的影响.方法 使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(Q法),NucliSens miniMag系统(M法)和匹基(PG)丙型肝炎病毒定量试剂盒自带RNA提取方法(P法)进行血清HCV RNA提取,实时荧光RT PCR定量检测,对77例临床血清标本进行了提取检测,同时设计了方法学评价实验,从准确度,重复性,线性和灵敏度方面评价3种方法.结果 77例临床标本的M、Q和P法阳性率分别是85.7%、84.4%和36.3%;25例共同阳性标本中,M和Q法的CT值分别比P法平均低7.5和9.35,表现出高于P法的提取效率和RNA质量;M和Q法的标准变异指数(S.D.I.)绝对值均<2,P法S.D.I.绝对值>2;M法平均CV为40.0%,Q法为71.0%,P法>100.0%;M法表现佳的线性(R>0.99),M、Q和P法的低检测限分别为39.4、394和3943 IU/ml.结论 从提取效率和收获RNA质量上M和Q法远远优于P法,进一步方法性能表明,M法为HCV RNA定量佳提取方法,而P法因其提取效率低、收获RNA质量差以及重复性不好,不适合临床HCV RNA定量试验.
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甘草不同器官RNA提取方法研究
目的 优选从甘草不同器官中提取高质量RNA的方法,为研究甘草药用成分合成酶基因克隆和基因表达奠定基础.方法 比较异硫氰酸胍法、柠檬酸钠法所提取的甘草根木质部、根皮部、根茎、叶中RNA的纯度和得率.结果 异硫氰酸胍法能从根的木质部、根皮部和根茎中提取出质量较好的RNA,但不能从甘草叶片中提出RNA;柠檬酸钠法能从叶片中提取出质量较高的RNA.结论 异硫氰酸胍法和柠檬酸钠法分别是提取甘草根木质部、根皮部和根茎及叶片中RNA的有效方法.
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Trizol RNA提取法在雪貂组织的流感病毒H3N2定量PCR检测中优于RNeasy mini kit(Qiagen)柱子法
目的 比较RNeasy mini kit (Qiagen)柱子法和Trizol法提取RNA在雪貂肺和肠组织H3N2 SYBR Green PCR定量中的去干扰作用,从而找到适合该定量体系的RNA提取方法.方法 比较Trizol法,RNeasy mini kit柱子法,改良RNeasy mini kit柱子法1和改良RNeasy mini kit柱子法2提取肺肠组织RNA的质量,RNA逆转录成cDNA后,利用SYBR Green PCR方法检测样品中H3N2的载量,比较产物的特异性,综合评价RNA提取方法.结果 4种方法提取的肺和肠组织的RNA质量不相同,紫外分光光度仪测得RNeasy mini kit柱子法提取的RNA 的A260/280低于1.8,其余3种方法的A260/280在1.8～2.1之间,A260/230只有Trizol法能达到2.0左右,其余3种方法均远低于2.0.电泳可见Trizol法提取的RNA有3条带:28 s、18 s和5 s,而RNeasy mini kit柱子法的RNA除了有28 s、18 s外,还有基因组DNA,改良RNeasy mini kit柱子法1和2提取的RNA只有28 s和18s带.RNA逆转录后进行荧光定量PCR,从溶解曲线看,不论是鼻甲刮取物还是肺肠组织的样品模板,4种方法获得的样品与标准品均为单一峰溶解曲线峰,并且波峰位置重叠.而鼻甲刮取物定量的产物跑琼脂糖凝胶电泳均为单一的特异性条带,而肺肠组织的产物电泳发现:Trizol法获得的模板定量产物与标准品一致,为单一的特异性条带,而其它3种方法获得的模板则均有非特异性条带.结论 鼻甲刮取物的病毒定量选用RNeasy mini kit柱子法提取定量结果与Trizol法一样可靠,说明对于简单样品该体系及引物非常适用,结果可信.对于组织样品肺和肠,Trizol法获得的样品定量结果比其它3种方法可靠.
关键词： 雪貂 H3N2 RNA提取 SYBR Green荧光定量PCR -
C57BL/6J小鼠脂肪组织总RNA提取及周脂素基因的克隆
目的 用改进后的方法提取高质量的RNA,以此为模板,应用T-A克隆法克隆C57BL/6J小鼠周脂素基因编码区,对其进行测序验证,并与GenBank比对.方法 在试剂说明书基础上,改进提取脂肪组织RNA的方法,从C57BL/6J附睾脂肪组织提取高质量的总RNA,用RT-PCR扩增出周脂素编码区基因,并将目的基因编码区克隆入pMD18-T载体中,转化E-coli JM109后,筛选阳性克隆,通过限制性内切酶酶切鉴定后,对其进行测序验证,并与GenBank比对.结果 用改进后的方法成功提取出了高质量的总RNA,并且成功提取构建的重组载体中含有周脂素基因的全长序列,与GenBank公布的序列一致.结论 改进的后的脂肪组织RNA提取方法是可行的,并获得周脂素基因的cDNA.为进一步研究其生物学功能奠定了基础.
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手工组织显微切割食管癌不同病变阶段细胞提取高质量RNA
目的建立手工组织显微切割方法准确挖取食管癌不同病变阶段细胞,从中提取高质量RNA,以满足后续基因表达分析的需要.方法常规制备冰冻组织切片,用无水乙醇一次性脱水固定,显微镜下用1 ml注射器针头从组织冰冻切片中分别挖取不同病变阶段的细胞,用TRIzol提取总RNA.结果手工挖取面积可准确到1/25 mm2,从挖取的细胞中提取出高质量的总RNA,凝胶电泳分析见清晰的18S和28S rRNA带,可满足后续分子水平研究的要求.结论无水乙醇固定冰冻组织切片可有效保存RNA的完整性,手工组织显微切割能够准确挖取小至1/25 mm2面积的细胞,方法简单、易掌握、易操作,不须特殊仪器设备,适合在一般实验室推广应用.
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椎间盘终板软骨组织总BNA的提取
高持量的RNA分离是进行基因表达的研究的基础.
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改良TRIzol法提取肿瘤细胞琼脂克隆的总RNA
琼脂克隆形成实验是肿瘤研究领域中一种重要的体外实验，可用于筛选转化细胞、评价肿瘤细胞药物敏感性[1]等.有研究表明,琼脂克隆形成实验筛选的肿瘤细胞具有肿瘤干细胞的特性[2],有更强的致瘤性和转移能力[3].
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萃取和保存条件对人外周血细胞RNA提取效果的影响
目的 比较不同处理和保存条件下外周血RNA提取效果,找出优的提取方案.方法 外周全血去除血浆后,经氯仿萃取两次,加入不同体积比的RNAiso Plus试剂,对RNA进行提取.在此基础上,比较不同保存条件对RNA提取效果的影响,保存条件分别为:4℃保存24h、72 h、10d,-80℃保存10d、30 d.通过紫外分光光度法测定RNA纯度和浓度,比较RNA提取效果,找出优提取方案.结果 与氯仿萃取一次相比,氯仿萃取两次提取的RNA纯度和浓度均升高,差异有统计学意义(P＜0.05);血细胞与RNAiso plus试剂体积比为1∶1时提取效果好;4℃保存10d内的RNA提取效果优于其他保存条件.结论 血细胞经氯仿萃取两次提取效果更好;加入等体积的RNAiso plus试剂提取效果好;血细胞可在4℃稳定保存长达10d,其RNA不被降解.
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半夏叶片总RNA四种提取方法及效果的比较
目的 针对三叶半夏成熟叶片化学成分复杂,富含多糖、酚类及其他多种化学物质的特点,选择优化一种简便、经济、高效的半夏成熟叶片高质量总RNA提取方法.方法 用4种不同的RNA抽提方法如异硫氰酸胍法、皂土法、CTAB-LiCl法和改进的SDS/酚法提取总RNA,通过电泳、紫外分光光度计检测以及RT-PCR验证等对提取结果进行分析比较.结果 4种方法均能从半夏成熟叶片中提取到总RNA.其中皂土法的提取过程只需3～4h,是其他3种提取方法所用时间的一半.提取1g叶片的成本只有其他3种方法的1/13～1/14.此法提取的总RNA 18S、28S带型清晰无弥散,完整性好,无严重的蛋白质和其他杂质污染,A260/A280为1.8～2.0,A260/A230大于2.0,且总RNA的产率高,为365.744 μg/g鲜重,提取的总RNA适用于RT-PCR试验.结论 皂土法提取的RNA完全适用于DDRT-PCR、Northern blotting、cDNA文库构建等分子生物学研究,是一种快速、经济,适于抽提半夏总RNA的好方法.
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少量造血细胞RNA提取方法学探讨
骨髓中的造血细胞是一个包括了从多能造血干细胞至成熟细胞不同分化阶段及粒系、淋系等不同分化系列的复杂群体.为了解不同细胞群体各种基因的表达情况,需要采用流式细胞术或磁珠分选出特定的细胞群,再进行RNA提取、PCR等过程.不过造血干/祖细胞等细胞群往往数目不多.而'TRIzol等常规RNA提取方法要求细胞数应该在105以上,因此需要采用特殊的少量细胞RNA提取方法.我们将对两种少量细胞RNA提取方法作一比较.
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灭蚊真菌贵阳腐霉总RNA提取方法的建立
①目的 提取贵阳腐霉(Pythium guiyangense)的总RNA.②方法 诱导后的菌丝加入硅藻土,用液氮研磨成粉末状,在变性剂存在的条件下,用酚/氯仿/异戊醇抽提,除去DNA和蛋白质,再用醋酸钠和70%乙醇沉淀RNA,去除多糖.③结果 用该方法提取的RNA 样品,经紫外分光光度计检测,OD260/OD280＝1.98,OD260/OD230＝2.30;1%琼脂糖凝胶电泳检测,28SrRNA带的亮度约为18SrRNA带的2倍.④结论 成功地提取了贵阳腐霉总RNA,且RNA的纯度和完整性很好,能够达到进行分子生物学领域其他操作研究的标准.
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适于基因芯片实验的小鼠脑组织RNA提取方法的改进
目的 比较Trizol与两种常用提取试剂盒对小鼠脑组织RNA提取质量的差异,并进行方法改进,以期找到适合于基因芯片的高质量组织RNA提取方法. 方法 以小鼠脑组织为材料,Trizol试剂、Ambion和天根组织RNA提取试剂盒提取总RNA,并对试剂盒提取方法进行改良,检测改良前后RNA浓度、纯度和完整性以及反转录成cRNA的浓度. 结果 与改良前相比,试剂盒经方法改良后提取的RNA产量均有提高;Ambion试剂盒提取的RNA纯度优于Trizol和天根试剂盒. 结论 Ambion试剂盒经方法改良后RNA提取质量优于其他方法,适合于基因芯片的实验要求.
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不同方法提取SD大鼠膝关节软骨组织的总RNA
背景：目前文献报道的软骨RNA提取有多钟方法，国内文献报道多为经典Trizol法，在实验中发现该方法提取的RNA并不能满足后续实验的需要。
目的：探索不同方法提取SD大鼠软骨组织总RNA的区别。
方法：选取3月龄SD大鼠9只，分别采用Rneasy Lipid Tissue Kit、RNAout试剂盒和经典Trizol法对软骨组织进行总RNA提取，并通过RNA琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，以探寻软骨总RNA佳提取方案。
结果与结论：Trizol法提取的RNA A260/A280值为1.58，说明纯度不高；RNAout法提取的RNA，由于软骨含有大量的蛋白多糖和胶原，也不能满足后续实验的需要；RNeasy? Mini Kit法和肝(Trizol)法提取RNA的A260/A280值分别为2.00和1.98，说明提取的总RNA或核酸的纯度高。RNA的完整性电泳结果显示， RNeasy? Mini Kit法、RNAout法和肝(Trizol)法可见28 s、18 s及5 s条带，而Trizol法未见任何条带， RNAout法28 s和18 s条带不清楚。结果提示Rneasy Lipid Tissue Kit法获得的总RNA纯度高、完整性和稳定性好，并能成功反转录合成双链cDNA，而RNAout试剂盒和经典 Trizol法获得的总 RNA不能满足后续实验需要。 -
不同保存和处理方式对全血标本总RNA提取的影响
目的 分析全血标本RNA提取的影响因素,并对全血RNA提取条件进行优化.方法 收集100例全血标本,混匀后分为低渗红细胞溶解组(A组,50例)和全血直接提取组(B组,50例),利用Trizol试剂提取放置在不同温度、不同保存时间的全血标本总RNA,并采用Ur-2401紫外分光光度计测定其浓度和纯度;另选60例全血标本作为反复冻融组(C组),取不同次数反复冻融的全血标本利用Trizol法直接提取其RNA.结果 A组和B组新鲜标本中所获取的RNA浓度分别为450.0 ng/μL和458.8 ng/μL,37℃保存7d标本中的RNA浓度分别为374.8 ng/μL和375.2 ng/μL,不同的保存温度与时间均对总RNA浓度(P=0.003、P =0.002)和纯度(P值均为0.011)的差异均有统计学意义,而相同条件下提取的总RNA浓度和纯度的差异无统计学意义(P =0.984、P=0.311);C组全血标本反复冻融的次数与保存时间对总RNA浓度(P=0.002、P=0.001)、纯度(P值均为0.008)差异均有统计学意义,而保存温度对总RNA浓度和纯度差异无统计学意义(P =0.611、P=0.362).结论 不同条件下全血标本中所获取的总RNA浓度有所差异,但在总RNA纯度和成功率方面,低渗破坏红细胞法优于直接全血提取法,反复冻融影响全血RNA提取效率和得率.
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白色念珠菌总RNA的提取方法
目的:探讨提取白色念珠菌总RNA的方法.方法:白色念珠菌标准菌株经SDA培养基培养后,采用改良的异硫氰酸胍一步法提取总RNA.以此为基础,进行反转录PCR反应.结果:得到的RNA经过紫外分光光度计检测浓度达到0.7g·L-1以上;琼脂糖凝胶电泳证实为完整、均一的总RNA;将此法提取的RNA反转录成cDNA后经过PCR扩增,可获得清晰的目的条带.结论:该方法简便、快速,提取的总RNA可以用于进一步基因克隆、表达.
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桑叶片总RNA提取方法的比较研究
目的 研究桑叶片总RNA的提取方法.方法 采用Trizol法、CTAB法及RNA prep prue Plant Kit提取试剂盒提取法,分别提取桑叶片中的总RNA,并通过紫外光谱、琼脂糖凝胶电泳及RT-PCR对提取效果进行分析比较.结果 3种方法均能从桑叶片中提取分离到总RNA,其中Trizol法能提取纯度较高、完整性较好的RNA,18S及28S带型清晰无弥散,A260/A280值为1.99,RNA产率为594.24μg/g,提取的总RNA适用于RT-PCR实验.结论 用Trizol法提取的桑叶片中总RNA可用于cDNA基因文库的构建及基因表达的差异分析.
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福尔马林固定石蜡包埋组织microRNA提取方法及质量控制
迄今为止,病理学诊断技术已从传统的大体解剖病理学和组织形态学诊断,发展到与免疫组织化学、原位杂交、DNA片段分析等分子诊断技术相互结合的新阶段.形态学诊断虽仍是病理诊断的基础和重要依据,但分子检测技术提供了更丰富的信息作为辅助,进而指导临床治疗.
关键词： microRNA RNA提取 福尔马林固定石蜡包埋组织
