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116例脐血PCR-SSP和PCR-SSOP的HLA-DR分型结果分析
脐血中富含造血干细胞。造血干细胞移植是治疗多种危重病患者的有效手段。移植前的HLA分型是决定其移植成功的重要环节之一。器官移植供受者间HLA-DR不相容可引起急性移植物抗宿主反应(GVHD)。因此，脐血移植中需有精确的HLA-DR基因分型。 本研究从1999年1月至7月对脐血库的116例标本分别用PCR-SSP和PCR-SSOP法检测，分析结果如下。材料和方法标本来源：116例标本来自本院脐血库中的脐血标本。 标本的DNA提取：脐血标本为ACD-B抗凝血，取200μl作盐酸胍法抽提DNA〔1〕。 PCR-SSP方法：采用美国莱姆德公司的Micro SSPTM试剂盒。操作方法按试剂盒说明书进行。PCR产物常规琼脂糖电泳后，EB染色，自动成像仪照相。利用人工和电脑软件同时判读实验结果。
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电泳法检测肝和血清中醇脱氢酶同工酶
目的:建立琼脂糖凝胶电泳法检测人血清醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase isoenzymes ADH EC 1.1.1.1)同工酶.方法:采用自制琼脂糖凝胶板,摸索实验条件,在pH 8.6,74 mmol/L巴比妥电泳缓冲系统中进行20 mA、20 min电泳,可清晰地分离出ADH同工酶三条区带.结果:检测了67例患者血清ADH总活性0.013-0.021 Kat/L,同工酶ADH Ⅰ占ADH总活性0.01-0.30,ADHⅡ占ADH总活性0.12-0.31,ADHⅢ占ADH总活性0.39-0.80.检测了10例人健康肝组织匀浆的ADH总活性为0.136-0.196Kat/L,同工酶ADH Ⅰ占总活性的0.07-0.25,同工酶ADHⅡ占总活性的0.19-0.27和同工酶ADHⅢ占总活性的0.56-0.73.结论:正常人血清中ADH酶活性很低,为0-1.8×10-3 Kat/L,其同工酶不易被检测出.而肝脏组织中含有大量ADH酶活性,当肝脏受到严重损伤时,ADH即从肝细胞内逸出,进入血液,使血清中ADH酶活性明显升高,同时通过琼脂糖电泳对其同工酶的检测可测出三条区带,帮助临床进一步了解肝细胞损伤程度,对患者预后和病程的监测具有一定的临床意义.
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肝癌中基质金属蛋白酶-9表达的临床意义
已有资料表明，肿瘤细胞能分泌大量基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP），且具有高转移倾向的肿瘤细胞分泌的金属蛋白酶的含量亦高，对肿瘤的侵袭和转移起着极为重要的作用〔1〕。基质金属蛋白酶-9（MMP-9，E.C.）是金属蛋白酶类的主要成员之一。我们应用逆转录聚合酶链反应和明胶酶谱法检测肝细胞癌（HCC）组织、癌栓组织和癌旁组织中MMP-9 mRNA的表达水平和酶活性表达，以探讨其在HCC侵袭和转移过程中的意义。 1.资料与方法：7例正常肝组织，47例手术切除并病理证实的癌及癌旁组织，其中8例有门静脉主干癌栓。有包膜者25例，无包膜者22例。大肝癌24例（>5 cm），小肝癌23例（≤5 cm）。所有病例均无肝外转移征象。方法：(1)RT-PCR：使用Trizol溶液一步提取mRNA，条件为94℃ 1 min，65℃ 1 min，循环30次。扩增条带特异性经酶切分析证实。PCR产物经2%琼脂糖电泳，VDS扫描。以MMP-9和内标β-actin扫描值的比值作为MMP-9 mRNA的表达相对值，半定量分析MMP-9 mRNA表达水平。(2)明胶酶谱法：制备蛋白抽提液，行SDS-PAGE电泳后，将凝胶分别置于洗脱液、漂洗液、孵育液、染色液、脱色液中处理，后拍照。(3)统计学处理：MMP-9 mRNA表达相对值以±S，两组间均数采用t检验，两组间率采用χ2检验。
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错配修复、微卫星不稳定性与散发性结肠直肠癌
近年来研究发现DNA修复基因突变引起DNA错配修复系统的功能降低或丧失，从而引起遗传物质不稳定，主要表现为微卫星不稳定性，进而导致肿瘤的发生。我们采用PCR技术对48例散发性结肠直肠癌检测了错配修复基因hmsh3、hmsh6和4个位点的微卫星不稳定性，现将结果报告如下。 1．材料与方法：(1)临床资料：我院1997～1998年经手术切除的新鲜结、直肠癌标本48例，其中男女各24例；年龄26～72岁，平均53岁；结肠癌29例（右半结肠癌15例，左半结肠癌14例），直肠癌19例；高分化癌19例，中分化癌22例，低分化癌7例；22例伴淋巴结转移；Dukes A期10例、B期及C期各14例、D期10例。（2）基因组DNA的提取：本组病例标本DNA提取方法参照文献［1，2］，48例标本的DNA均经琼脂糖电泳，溴乙锭染色，并在紫外灯下观察证实DNA提取成功。（3）错配修复基因突变的检测：应用PCR技术对提取的48对基因组DNA进行hmsh3和hmsh6基因突变的检测。（4）微卫星DNA引物：由上海生物工程公司合成。（5）PCR扩增与分析：方法见文献［3，4］。（6）结果判定：与相应正常组织细胞DNA的微卫星扩增片段比较，出现额外的DNA等位片段或等位片段出现缺失，等位带的移动、强度增加或获得额外的带型均为阳性。（7）统计学处理：数据的分析应用χ2检验和t检验。
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急性心肌梗死患者血清乳酸脱氢酶同工酶电泳出现第六带临床意义探讨
绝大多数人血清中的乳酸脱氢酶(LDH)同工酶经琼脂糖电泳并显色后只有LDH1～LDH55条色带.急性心肌梗死患者若出现充血性心力衰竭、心源性休克等并发症,其血清LDH同工酶电泳图谱中有时会出现第六条色带,即LDH6,其处在LDH5的阴极端,这种患者的预后极差,现介绍如下.
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琼脂糖电泳法分离血清碱性肝型和骨型同工酶方法的改进
目的:介绍一种琼脂糖电泳法分离血清碱性磷酸酶肝型和骨型同工酶的改进方法.方法:将血清用神经氨酸苷酶处理,在此基础上选用四种缓冲液配制成0.7%的凝胶,加入1%的TritonX-100电泳,并进行荧光扫描.结果:四种缓冲液中巴比妥/HCL/EDTA缓冲液的分离效果好.加入神经氨酸苷酶改变了肝型和骨型的迁移率,使电泳分离距增宽.加入TritonX-100使各区带结合更紧密,同工酶更易分辨.结论:采用合适的缓冲液体系,使用神经氨酸苷酶和TritonX-100作为辅助手段并用荧光扫描,使定量测定肝及骨型同工酶成为可能,且灵敏度和精密度令人满意.
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艾滋病人血清蛋白电泳谱分析
采用美国Helena琼脂糖电泳技术测定100例艾滋病人(实验组),30名健康人(对照组)的血清蛋白电泳,用双缩脲法测血清总蛋白,用溴甲酚绿法测白蛋白.实验组总蛋白与对照组无显著性差异[实验组(78.35±6.10)g/L,对照组(79.42±3.01)g/L P＞0.05]实验组白蛋白与对照组无显著性差异[实验组(41.86±4.88)g/L,对照组(42.85±2.04)g/L P＞0.05];
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精浆蛋白质电泳两种分析方法的探讨
目的: 探讨琼脂糖电泳和SDS-琼脂糖电泳分析精浆蛋白质的临床可行性. 方法: 69例不育患者精液标本按常规和特殊检查结果分为弱畸精子症(n=19)、弱精子症(n=22)和相对正常(n=28)3组,然后离心分离获取精浆.分别采用琼脂糖和SDS-琼脂糖作介质,不同的点样时间、迁移功率,酸性结晶紫和氨基黑两种染色,对精浆蛋白质进行检测,将电泳图谱进行吸光度仪扫描并将结果对比分析. 结果: 以SDS-琼脂糖作介质,酸性结晶紫染色可将精浆分为4条带,但区带弥散,相互间拖尾严重;以琼脂糖作介质,pH9.2碱性缓冲条件,点样6 min,可将精浆分为A、B、C、D、E、F 6条带,氨基黑染色后,区带清晰,间隔适当,易于吸光度仪分析相对含量,重复性好.电泳结果经方差分析,弱精子症组与相对正常组、弱畸精子症组在C与E带上均有差别,而相对正常组与弱畸精子组无差别;同时,相对正常组标本之间的电泳图谱也有显著的不同. 结论: 以琼脂糖作介质,在碱性缓冲条件下电泳,氨基黑染色来分离检测精浆蛋白质具有较高的可行性,该方法操作简单、快速,可适合临床常规开展.
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毛细管区带电泳分离血清蛋白的进展
毛细管区带电泳(Capillary Zone Electrophoresis,CZE)用于血清蛋白分离的临床应用是在二十世纪90年代早中期开始的[1].在这期间,用于血清蛋白分离的琼脂糖电泳(AGE)与CZE方法比较的文章已有报道.报告指出,使用一个单一的毛细管设备,CZE给出的血清蛋白分离图谱能够与AGE相媲美.
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微型磁笔提取DNA的应用
目的 探索用微型磁笔进行DNA快速提取以及电泳鉴定的研究.方法 取人血0.1 ml或菜叶0.1g,磁珠悬液0.25 ml,选择性结合DNA、洗涤、洗脱、电泳即得.不需离心,不用大量检材,用微型磁笔在离心管中微量操作,分离纯化DNA只需30 min,电泳只需50 min.结果 可以观察到清楚明亮的DNA条带,使大、中学师生同时掌握了正规DNA提取和琼脂糖电泳两项技能.结论 本方法是对细胞生物学、医学遗传学实验的一大改进,对于DNA的提取是一大进步,它操作简捷直观、速度及准确率大为提高.
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山莨菪碱减轻TNF-α所致内皮细胞凋亡
目的:从转录因子水平观察山莨菪碱能否减轻TNF-α所致内皮细胞的凋亡,并探讨其机制是否与其抑制NF-κB活化有关.方法:培养小牛肺动脉内皮细胞(BPAEC),将山莨菪碱(0.2 mg/mL)加入细胞培养基中,30 min后再加入TNF-α(2500 U/mL)损伤24 h,采用Hoechst 33258染色,荧光显微镜观察细胞凋亡情况,并进行显微照相.采用Sellin法抽提细胞上清片段DNA及琼脂糖电泳,观察是否出现DNA梯状条带,用二苯胺法测定上清液及沉淀物中DNA含量,计算细胞DNA断裂百分率.BPAEC表达I-κBα及iNOS的Western blot印迹分析及用凝胶滞留法EMSA检测NF-κB活性.结果:山莨菪碱能明显减轻TNF-α所致的BPAEC凋亡,表现为荧光显微镜下凋亡细胞减少,未见明显梯状条带,DNA断裂百分率也明显减少.山莨菪碱抑制TNF-α所致的I-κBα的含量下降及NF-κB的活化,并抑制TNF-α所致的NF-κB从胞浆向胞核的移位.另外山莨菪碱能减少因TNF-α刺激所引起的BPAEC表达iNOS的增加.结论:山莨菪碱减轻TNF-α所致的内皮细胞凋亡,可能与山莨菪碱抑制NF-κB激活,从而抑制iNOS合成有关.
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聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳和琼脂糖水平电泳检测基因型的比较研究
目的 比较聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）垂直板法-银染和琼脂糖凝胶水平电泳应用于环氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）-1195GA基因型检测的效果.方法 由两名实验人员分别应用PAGE垂直板法-银染和琼脂糖水平电泳两种方法 读取100例患者的COX-2-1195GA基因型,比较结果一致性以及两种方法的特点.结果 两种方法检测结果符合率100％.PAGE垂直板法-银染灵敏度较高,但技术难度较大,操作时间长,成本高,图片较难编辑；琼脂糖凝胶水平电泳可分离相差50 bp的片段,且操作简单,节省时间,图片易编辑.结论 在酶切片段易于分离检测时,琼脂糖凝胶水平电泳可推广应用于聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析的基因型检测.
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碱性磷酸酶同工酶分析在肝、骨性疾病中的鉴别应用
目的对电泳后的碱性磷酸酶(ALP)同工酶进行定量分析测定,用于鉴别诊断肝、骨疾病.方法总ALP活性用日立747测定,将收集的ALP总活性升高的血清用神经氨酸酶处理后,在HELENA电泳仪上做琼脂糖电泳.结果电泳后可将ALP同工酶分成几个独立的区带,其中以肝型及骨型ALP为主,可用于鉴别肝脏疾病、骨疾病及癌症骨转移疾病.结论神经氨酸酶处理的血清经电泳后,能够更加准确的为ALP总活性升高的患者确诊.
