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凝胶滞留法测定铁调节蛋白结合活性方法的建立
细胞铁代谢的自稳态是维持正常细胞功能的关键环节,转铁蛋白受体(TfR)和铁蛋白(Fn)在控制铁的摄取、贮存过程中起重要作用, 这两种蛋白的表达存在一种转录后调节机制,胞浆中的铁调节蛋白(IRP)可与存在于TfR、Fn 3′端或5′端非翻译区(UTR)的铁反应元件(IRE)结合,控制TfR、Fn的表达.目前的研究结果表明,除细胞内铁水平外,其它因素,如一氧化氮(NO)、H2O2、细胞增殖或分化、缺氧等均可影响IRP与IRE的结合活性,从而调节细胞铁代谢[1-3].我们旨在建立铁调节蛋白结合活性的测定方法,为铁代谢研究打下方法学基础.
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晚期糖基化终产物激活内皮细胞核因子κB
目的 探讨晚期糖基化终产物对人血管内皮细胞核因子κB的激活及作用机制.方法 用晚期糖基化终产物修饰的人血清白蛋白与人脐静脉内皮细胞株ECV304体外共同培养.用Western blot检测核因子κB抑制蛋白水平,凝胶滞留法检测核因子κB的活性.结果 晚期糖基化终产物修饰的人血清白蛋白可致ECV304核因子κB抑制蛋白降解及核因子κB激活,并且呈时间、剂量依赖关系,抑制核因子κB抑制蛋白的降解,可抑制核因子κB的激活.结论 晚期糖基化终产物修饰的人血清白蛋白通过引起核因子κB抑制蛋白降解,导致核因子κB的激活,这一作用机制可能参与动脉粥样硬化的进程.
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山莨菪碱减轻TNF-α所致内皮细胞凋亡
目的:从转录因子水平观察山莨菪碱能否减轻TNF-α所致内皮细胞的凋亡,并探讨其机制是否与其抑制NF-κB活化有关.方法:培养小牛肺动脉内皮细胞(BPAEC),将山莨菪碱(0.2 mg/mL)加入细胞培养基中,30 min后再加入TNF-α(2500 U/mL)损伤24 h,采用Hoechst 33258染色,荧光显微镜观察细胞凋亡情况,并进行显微照相.采用Sellin法抽提细胞上清片段DNA及琼脂糖电泳,观察是否出现DNA梯状条带,用二苯胺法测定上清液及沉淀物中DNA含量,计算细胞DNA断裂百分率.BPAEC表达I-κBα及iNOS的Western blot印迹分析及用凝胶滞留法EMSA检测NF-κB活性.结果:山莨菪碱能明显减轻TNF-α所致的BPAEC凋亡,表现为荧光显微镜下凋亡细胞减少,未见明显梯状条带,DNA断裂百分率也明显减少.山莨菪碱抑制TNF-α所致的I-κBα的含量下降及NF-κB的活化,并抑制TNF-α所致的NF-κB从胞浆向胞核的移位.另外山莨菪碱能减少因TNF-α刺激所引起的BPAEC表达iNOS的增加.结论:山莨菪碱减轻TNF-α所致的内皮细胞凋亡,可能与山莨菪碱抑制NF-κB激活,从而抑制iNOS合成有关.
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小鼠脾细胞核蛋白提取及核因子-κB活性的检测
应用高盐溶液提取法,高速离心分离纯化创伤小鼠脾细胞核蛋白,其核提取物经蛋白电泳分析,可见清晰蛋白条带。凝胶滞留法检测NF-κB的DNA结合活性灵敏可靠。该方法的建立,为研究基因转录调控的表达奠定了基础。