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尿路致病性大肠杆菌fimC和fimH基因诱导小鼠免疫应答的初步研究
尿路致病性大肠杆菌(UPEC)是引起尿路感染的主要病原菌.此类大肠杆菌80%携带Ⅰ型菌毛.现已证明UPEC的Ⅰ型菌毛的编码基因位于染色体上,由9个基因组成.其中fimH基因编码的蛋白--FimH粘附素,能与泌尿道上皮细胞表面甘露糖受体结合并可诱导细菌的细胞内在化.FimC蛋白是FimH蛋白的伴侣分子,在保持Ⅰ型菌毛的折叠和长度上起着关键的作用,可增强FimH蛋白的免疫原性[1].Langermann等制备FimH和FimC纯化蛋白混合疫苗,可以诱发动物产生抗Ⅰ型菌毛抗体,使猴对UPEC的感染有保护作用[2,3].
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热休克蛋白家族在睾丸中的表达及意义
作为分子伴侣的热休克蛋白协助蛋白质在胞质、线粒体、内质网中正确折叠、翻译和组装以及调控雄激素受体的进出,它们在细胞分裂和发育中起着关键作用.近年来发现,睾丸组织细胞热休克蛋白表达与男性不育关系密切,现对睾丸中主要热休克蛋白的表达及其相关分子研究进展作一综述.
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Nrf2-Keap1抗氧化系统研究进展
Nrf2(NF-E2-related factor2)是细胞调节抗氧化应激反应的重要转录因子,生理状态下它与胞浆蛋白伴侣分子Keap1(Kelch-like ECH-associated protein1)结合使活性处于相对抑制状态.氧化应激源作用下,Nrf2与Keap1解偶连后转移入核,与抗氧化反应元件ARE(antioxidant response element)上GCTGAGTCA位点结合,启动ARE调控的第II相解毒酶及抗氧化酶基因表达,增加细胞对氧化应激的抗性.Nrf2缺失或激活障碍,可加重氧化应激源的细胞毒性,导致细胞功能障碍、凋亡甚至死亡.本文对Nrf2-Keap 1解偶连机制和Nrf2功能的新研究进展做一综述.
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家蝇Cecropin A分子体外表达及抗菌活性鉴定
目的 体外重组表达家蝇天蚕素多肽分子,并对重组表达产物活性进行初步鉴定.方法 克隆家蝇天蚕素成熟肽(Mature Cecropin,MC)基因,构建pET32a-MC重组质粒.转化大肠杆菌(E.coli) BL21(DE3)中.1 mmol/L终浓度的IPTG诱导重组蛋白Thioredoxin(硫氧还蛋白,Trx)-MC表达.重组蛋白质纯化回收后经胃蛋白酶水解获得天蚕素多肽分子.用重组蛋白和天蚕素多肽分子进行抑菌试验鉴定其生物活性.结果 MC多肽分子体外具有较强的抑菌活性,且抑菌活性持续时间长.结论 硫氧还蛋白在重组蛋白质中作为分子伴侣改变了天蚕素多肽分子生物活性,使其对宿主菌低毒性.MC多肽分子的体外长效抑菌能力使其具有良好的应用前景.
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天蚕素多肽分子对大肠埃希菌的抑制作用
目的 体外重组表达家蝇天蚕素成熟肽分子,观察其对临床分离的多重耐药大肠埃希菌(E.coli)体外抑制作用.方法 PCR克隆天蚕素成熟肽(Mature Cecropin,MC)基因,在MC基因前加入色氨酸密码子(TGG)连接于pET32a质粒的硫氧还蛋白基因后,构建重组质粒pET32a-MC.转化E.coli/BL21(DE3)中.IPTG诱导重组融合蛋白质Thioredoxin(硫氧还蛋白,Trx)-MC表达.融合蛋白质纯化后,经胃蛋白酶37 ℃水解.融合蛋白质中的天蚕素氨基酸序列具有抗胃蛋白酶能力不被水解,融合蛋白质其余部分被胃蛋白酶水解成小于2 kD的碎片,使用透析袋分离、纯化、浓缩,获得天蚕素成熟肽分子.水解产物经Tricine-SDS-PAGE验证,获得一条与天蚕素分子大小相近的条带.采用液态生长抑制试验检验天蚕素分子对E.coli抑制作用,观察其对标准菌株ATCC 25922及临床分离多重耐药菌株的抑制活性.结果 MC成熟肽分子体外对E.coli标准菌株的抑制活性较强,标准菌株较多重耐药菌株受抑制得更快,但两者均能被天蚕素分子抑制.结论 天蚕素多肽分子对E.coli多重耐药菌株具有抑制作用.
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应用伴侣分子在大肠杆菌表达系统高效表达家蝇天蚕素
目的 应用伴侣分子在大肠杆菌表达系统中高效表达家蝇天蚕素,研究伴侣分子对家蝇天蚕素基因在大肠杆菌中表达的影响.方法 RT-PCR克隆家蝇的天蚕素成熟肽(mature cecropin,MC)与泛素(ubiquitin,UBI)基因,利用牛物信息学方法分析硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)-MC和MC分子结构及Trx-MC分子和Trx-UBI-MC两种融合蛋白mRNA 5'端的二级结构的异同.分别构建pET32a-MC和pET32a-UBI-MC两种重组质粒,转化入大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中.检测Trx-MC融合蛋白的表达和pET32a-MC和pET32a-UBI-MC在相同诱导时间及诱导剂浓度的条件下,融合蛋白表达量的差异.结果 生物信息学分析结果显示MC分子被Trx分子包裹在其内部,MC分子的细胞毒性被去除,使其可以在大肠杆菌中正常表达.分子生物学实验结果进一步验证了生物信息学分析结果的正确性.同时,也显示UBI分子的加入,未影响融合蛋白质Trx-UBI-MC与Trx-MC的mRNA5'端二级结构.并且Trx-UBI-MC融合蛋白在全菌蛋白中的含量明显高于Trx-MC.结论 Trx作为伴侣分子包裹了MC的天然结构.使其对宿主菌无毒性.UBI作为伴侣分子,在相同转录水平、翻译水平条件下,明显提高了蛋白的表达量.
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结肠癌富伴侣分子疫苗的制备及其抗癌作用研究
目的 研究高效结肠癌富伴侣分子疫苗的制备及其抗癌治疗作用.方法 结肠癌CT26细胞在0.1 mg/L天花粉蛋白的培养基中不同温度下培养,诱导癌细胞伴侣分子的表达和抗原肽的合成.超声裂解并离心,盐析法分离上清蛋白,低温透析去除相对分子质量低于50 000和高于300 000的蛋白分子.凝胶过滤结合变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)收取相对分子质量70 000、90 000、95 000、110 000和170 000处峰段蛋白.对所获蛋白定性定量,检测不同蛋白复合物的T细胞增殖、抗结肠癌自然杀伤细胞(NK)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性等主要抗癌效应.结果 主要伴侣分子(HSP60、HSP70、HSP90、gp96、HSP110和HSP170)的抗原肽复合物被较好提取,制备了浓缩的富伴侣分子抗原肽.体外抗癌实验显示,相对于普通处理的瘤苗,各肠癌瘤苗的细胞增殖、NK和CTL细胞活性等主要抗癌效应均有明显提高(P<0.01).结论 凝胶过滤结合SDS-PAGE法可以更好地提取制备浓缩的富伴侣分子抗原肽:热应激和天花粉蛋白处理可使抗原肽的表达量增加和免疫原性提高,从而诱导出更强的抗癌免疫.其中42℃热应激加天花粉蛋白组瘤苗的抗癌作用强.
