首页 > 文献资料
-
基因重组幽门螺杆菌HspA-Zot融合蛋白质口服疫苗的研制
目的制备幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位(HspA)和霍乱弧菌封闭小带毒素(Zot)的重组融合蛋白质HspA-Zot(HZ);观察融合蛋白HZ经口服免疫后在小鼠小肠内的吸收情况;观察HZ经口服免疫后诱发小鼠产生的特异性免疫应答反应.方法①用PCR方法扩增HspA和Zot两个目的基因片段,将它们分别克隆至pSK(+)质粒上,然后插入含T7启动子pET-28a(+)的表达载体中,构建含双基因的表达质粒pET-hz,转化E,coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达高效的融合蛋白HZ;②融合蛋白经镍离子柱纯化、复性后,与HspA重组蛋白质共同标记同位素125I,经小鼠灌胃实验观察其在小鼠小肠内的吸收情况.结果①经测序,hspA-zot(hz)融合基因片段由1 575bp组成,为编码515个氨基酸残基的多肽.经SDS-PAGE检测发现,融合基因表达的蛋白质相对分子质量(M)r约为65×103.②标记同位素125I的HZ和HspA,经小鼠灌胃实验观察不同时间段的吸收情况,结果发现在5～10min时间段,HZ组出现吸收峰值,约为对照组的8.65倍(P＜0.001),且吸收峰值时间明显提前.结论融合蛋白质HZ经口服后可以在小鼠小肠内迅速被大量吸收,经口服免疫后可以刺激机体产生较高滴度特异性抗体.HZ可以作为预防和治疗幽门螺杆菌感染的候选口服疫苗株.
-
幽门螺杆菌HspA-CtxB口服疫苗的研制及免疫原性研究
目的观察幽门螺杆菌融合蛋白质热休克蛋白A-霍乱毒素B(HspA-CtxB,HCT)经口服免疫在小鼠小肠内的吸收情况及免疫后机体产生的免疫应答. 方法用PCR方法扩增hspA和ctxB 2个目的基因片段,将它们分别克隆至pSK(+)质粒上,然后插入含T7启动子pET-22b(+)的表达载体中,构建含双基因的表达质粒pET-hct,转化E.coli BL21(DE3),经 IPTG诱导表达融合蛋白质HCT;融合蛋白质经镍离子柱纯化、复性后,与HspA重组蛋白质共同标记同位素125I,经小鼠灌胃实验观察其在小鼠小肠内的吸收情况;HCT和HspA分别给小鼠灌胃进行免疫,每周灌胃2次,共8次,末次免疫后3d起收集小鼠粪便,次日眶后静脉采集静脉血,分别对标本进行IgG和IgA检测. 结果经测序,HspA-CtxB(HCT)融合基因片段由726bp组成,为编码242个氨基酸残基的多肽.经SDS-PAGE和免疫印迹分析检测发现,融合基因表达的蛋白质相对分子质量(M)r约为30×103.标记同位素125I的HCT和HspA,经小鼠灌胃实验观察不同时间段的吸收情况,结果发现在10～15min时间段,HCT组出现吸收峰值,约为对照组的8倍以上(P＜0.001),且吸收峰值时间明显提前;将HCT口服免疫小鼠,检测小鼠血清和粪便中的特异性抗体水平.结果HCT组(A405),血清IgA,2.98±0.35,血清IgG, 4.38±0.56,粪IgA, 2.89±0.68;HspA组(A405),血清IgA, 0.38±0.15,血清IgG,0.45±0.16;粪IgA, 0.69±0.23;正常对照(A405),血清IgA, 0.06±0.02,血清IgG, 0.09±0.06;粪IgA, 0.12±0.03. 结论融合蛋白质HCT经口服后可以在小鼠小肠内迅速地被吸收,经口服免疫后可以刺激机体产生较高滴度的特异性抗体.HCT可以作为预防和治疗幽门螺杆菌感染的候选口服疫苗株.
-
幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位基因工程菌的发酵
目的研究幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位(HspA)基因工程菌的发酵工艺.方法通过不同培养基、不同葡萄糖浓度、不同溶氧条件、补料与非补料对幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位基因工程菌的菌体生长与外源蛋白表达量的影响的比较,确定其较为合适的培养条件.结果多批实验证明,菌体单产可达42g/L,目的蛋白的表达率为38.5%.结论此发酵工艺可以提高HspA基因工程菌菌体的得率和目的蛋白的表达.
-
幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位融合蛋白表达的研究
目的获得大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)与幽门螺杆菌保护性抗原热休克蛋白A亚单位(HspA)的融合蛋白.方法 PCR扩增ltB和hspA基因,依次构建至表达载体pIM-1,转化大肠杆菌,SDS-PAGE、免疫印迹分析目的蛋白表达情况.采用GM1 ELISA和D(+)-半乳糖亲和层析方法检测重组LTB-HspA融合蛋白LTB组分与GM1神经节苷脂结合活性.结果重组LTB-HspA融合蛋白表达量高可达细菌总蛋白的25%.免疫印迹检测结果证实为重组LTB-HspA融合蛋白.GM1 ELISA和D(+)-半乳糖亲和层析方法检测结果证实重组LTB-HspA融合蛋白具有与GM1神经节苷脂结合的活性.结论 LTB-HspA融合蛋白的表达研究,为研制幽门螺杆菌分子内佐剂疫苗打下了基础.
关键词： 幽门螺杆菌 热休克蛋白A亚单位 大肠杆菌不耐热毒素B亚单位 融合蛋白 重组表达 -
重组幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的高效表达及其初步纯化
目的在大肠杆菌中高效表达幽门螺杆菌的热休克蛋白A基因(hspA), 并对其初步纯化.方法用巢式PCR扩增hspA基因.经测序证实后, 克隆于表达载体pIM-1中, 转化大肠杆菌.以SDS-PAGE和免疫印迹分析目的蛋白的表达, 并测定N-端氨基酸的序列.采用固相镍离子亲和层析, 对重组hspA进行初步纯化.结果扩增的hspA基因为357 bp, 并在大肠杆菌中得到高效可溶性表达.重组蛋白的表达量高可达细菌总蛋白的60.5%.免疫印迹及氨基酸测序结果证实, 表达产物为幽门螺杆菌hspA亚单位.固相镍离子亲和层析初步纯化的重组HspA的纯度为87.8%.结论 hspA亚单位的高效表达与初步纯化, 为批量获得Hp亚单位抗原打下了基础.
