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PDGF受体β亚单位2个不同切割位点核酶的体外切割效率的比较
目的研究针对大鼠PDGF受体β亚单位基因2个不同切割位点核酶的体外切割活性并加以比较.方法应用计算机对大鼠PDGF受体β亚单位mRNA二级结构进行模拟,设计针对PDGF受体β亚单位mRNA 45位CUU和252位CUU的锤头状(Hammerhead)核酶(Ribozyme)基因RZ1和RZ2,定点克隆于自我切割型核酶载体P1.5的5′-cis核酶和3′-cis核酶之间;将大鼠PDGF受体β亚单位cDNA 608 bp的PCR片段克隆于pGEM-T载体T7启动子下游,在T7启动子作用下分别体外转录成RZ1、RZ2和706 nt的PDGF受体β亚单位mRNA,比较RZ1和RZ2对706 nt的PDGF受体β亚单位mRNA的切割活性的差异.结果 RZ1在体外有较高的切割活性,而RZ2在体外无切割活性.结论提示在应用核酶技术进行基因治疗时,应选择有效的核酶切割位点,以达到有效的治疗目的.
关键词： 核酶 PDGF受体β亚单位 体外转录 体外切割 -
抗HPV16E6核酶的原核表达与体外活性研究
目的 获得一种特异性抗人乳头瘤病毒(HPV)16型E6基因的核酶,用以在基因调控水平预防、治疗HPV相关性肿瘤.方法 以核酶(ribozyme,Rz)的锤头结构为模型,采用计算机软件针对HPV16E6基因,设计相应的Rz;体外合成其基因后,克隆于原核表达质粒中.将HPV16E6基因片段也克隆于原核表达质粒中,通过体外转录而得到核酶和病毒mRNA,进行体外切割试验以鉴定核酶的活性.结果 抗HPV16E6核酶(简称抗16HRz)被装入pRG523中而构成pRG16HRz,体外转录后能将核酶独立地释放出来.HPV16E6 mRNA转录质粒pTZ16E6含有HPV16E6基因片段(+94位～+296位),体外切割实验证明抗16HRz具备切割活性,在体外能准确、有效地识别和切割HPV16E6 mRNA片段,得到82nt和132nt的切割产物.结论 所获得的抗HPV16E6核酶能特异性切割HPV16E6 mRNA,可作为对HPV相关性肿瘤进行基因治疗的工具.
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一种高效表达多肽或小分子蛋白平台的构建
目的克服小分子蛋白或多肽在大肠杆菌表达系统中易降解、表达量低的问题,为基因工程生产此类产品提供一种简便有效的解决方案. 方法以33个氨基酸的小分子蛋白(factor C的S3功能区)为例,用PCR方法扩增了基因,并克隆到载体pBBS.利用载体带有的BbsⅠ酶切位点特性和添加到引物上的特殊序列,使插入片段在体外定向连接成多联体,然后重新连接到pBBS. 结果成功构建了S3的二联体、四联体及八联体克隆.转移至表达载体pET22b后,在BL21细菌宿主中诱导表达.S3单体表达不明显,而四联体(rS3-4mer)表达量高.rS3-4mer经纯化后在酸性溶液中水解为rS3单体.以Western blot证明,多联体及其分解单体均可与S3抗血清特异性结合. 结论应用这一系统能有效地构建串联基因,从而提高小分子蛋白或多肽在大肠杆菌中的表达量.
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脱氧核酶对Period1 mRNA的体外切割及对小鼠吗啡奖赏效应的影响
目的研究脱氧核酶对Period1 mRNA的体外切割作用,及注射脱氧核酶对阿片类药物奖赏效应的影响.方法设计合成针对Period1(Per1)mRNA的脱氧核酶(DRz164),并构建pcDNA3.1(+)-Per1164体外转录载体;将体外转录产物和脱氧核酶按一定条件混合,检测脱氧核酶的体外切割效率.脑室注射DRz164,建立小鼠条件位置偏爱模型,观察脱氧核酶对吗啡奖赏效应的影响.结果 DRz164对Per1 mRNA组分有切割作用,在反应30、60、90和120 min的剪切百分率分别为36.4%、40.5%、47.8%和63%.给予DRz164后小鼠未能形成对吗啡的位置偏爱.结论 DRz164在体外能够切割per1 mRNA,在一定范围内剪切活性随时间延长而升高,小鼠脑室注射DRz164可拮抗吗啡所引起的奖赏效应,缓解对吗啡的精神依赖.
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抗肿瘤多药抗性核酶转录质粒的构建及其体外切割研究
目的探讨体外核酶对肿瘤多药抗性相关基因mdr1靶RNA分子的切割作用及其影响因素.方法利用计算机软件设计能特异切割mdr1 mRNA的锤头状核酶(ribozyme),并构建抗mdr1-ribozyme和靶分子的体外转录质粒,进行体外切割实验.结果发现抗mdr1-ribozyme能较好地切割mdr1 mRNA. 结论抗肿瘤多药抗性核酶的体外研究为其体内应用提供了参考,ribozyme有可能成为逆转肿瘤多药抗性的新药物.
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Bridge Sequence对M1GS核酶体外切割活性的影响
目的 探讨Bridge Sequence(桥序列)对M1GS核酶体外切割活性的影响,从而为人工M1GS核酶的优化设计提供一定的理论依据.方法 以含大肠杆菌核酶P催化单位(M1 RNA)基因的pFL117质粒作为模板,通过巧妙设计不同的下游引物,经PCR扩增、扩增产物克隆及克隆基因的体外转录,构建一组具有不同桥序列的人工M1GS核酶.进一步将所构建的上述人工M1GS核酶分别与同位素标记的底物RNA片段进行体外切割试验,并通过同位素扫描成像系统对各M1GS核酶的切割产物加以分析.结果 成功构建了针对HCMV UL54mRNA T7靶位的、四种不同桥序列长度的M1GS核酶,其桥序列长度分别为0nt、6nt、20nt和88nt,并依次命名为M1GS-T7(0)、M1GS-T7(6)、M1GS-T7(20)和M1GS-T7(88).经体外切割试验证实,M1GS-T7(88)的靶向切割活性强,M1GS-T7(20)的切割活性相对较弱,而M1GS-T7(0)及M1GS-T7(6)则无明显的切割活性.结论 人工M1GS核酶中桥序列的长度对于其体外切割活性具有重要影响,提示在人工M1GS核酶的优化设计时,桥序列的长度是不可忽视的因素之一.
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抗血小板衍生生长因子受体β亚单位核酶的体外制备与活性鉴定
] 目的研究针对血小板衍生生长因子(PDGF)受体β亚单位基因的核酶的制备与体外切割活性鉴定. 方法将大鼠PDGF受体β亚单位基因的PCR片段克隆于T载体T7启动子下游,32P标记的体外转录物作为靶RNA;设计并合成针对大鼠PDGF受体β亚单位胞外区的核酶,将核酶基因克隆于自我切割核酶载体P1.5的5′-cis核酶和3′-cis核酶之间,并进行32P标记的转录.核酶与靶RNA按一定比例和条件进行切割反应电泳,放射自显影. 结果核酶制备正确,在适条件下具有切割活性.其Km＝13.20nM,Kcat＝0.28min-1.高切割效率达78.3%. 结论体外制备的核酶具有良好的特异催化切割活性.[
