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脊髓灰质炎病毒载体研究进展
脊髓灰质炎病毒是小核糖核酸病毒科成员,是单正链RNA病毒.从上世纪八十年代以来,人们一直致力于发展脊髓灰质炎病毒载体,先后出现了抗原嵌合载体、PV复制子、多聚蛋白融合载体及双表达载体等类型.近年,脊髓灰质炎病毒载体用于在中枢神经系统中定点表达外源蛋白,引起了人们的重视.本文对脊髓灰质炎病毒载体的类型、特点、应用及新进展作一综述.
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外源蛋白在CHO细胞株中高效表达的策略
目的:随着基因工程技术的不断发展,目前已有多种表达系统可用于生产具有医疗价值的人或动物来源的蛋白质.真核细胞中CHO细胞与其他表达系统相比具有许多优点,是目前重组糖基蛋白生产的首选体系.本文着重阐述外源蛋白在CHO细胞中高效表达的策略.
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日本脑炎病毒(JEV)复制子表达载体的构建及其鉴定
在以往构建的JEV疫苗株SA14-14-2感染性克隆pBRkpn-JTF的基础上,构建了去除JEV结构区域基因(prM基因和E基因),保留非结构区域基因的复制子表达载体pCTCJEV、pCTMJEV,转染BHK-21细胞后,通过反转录PCR(RT-PCR)和间接免疫荧光实验(IFA)检测该载体的自主复制能力和蛋白表达情况,结果证实该载体在BHK-21细胞中能够自主复制并且表达非结构蛋白.进一步在该载体中插入报告基因EGFP,检测外源蛋白的表达情况,结果显示在转染复制子载体的24h后,荧光显微镜下能够看见绿色荧光蛋白的表达,阳性信号持续增强,能够维持10d左右,证实了构建的复制子载体pCTCJEV能够有效地表达外源蛋白,这为进一步建立以乙脑病毒复制子为基础的疫苗载体系统打下基础.
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大肠杆菌胞内的共表达策略
大肠杆菌表达系统因其具有系统工具成熟、表达水平高、易于操作和成本低廉等优点而成为表达外源蛋白常用的表达系统之一.但该系统在表达外源蛋白,尤其是真核蛋白时也存在不少缺陷,其中主要的是由于大肠杆菌胞内缺乏帮助蛋白正确折叠的机制,所以相当一部分在大肠杆菌中表达的外源蛋白都聚集成沉淀,即以包涵体的形式存在,从而丧失了生物活性.
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IL-28A在家蚕BmN细胞及蛹中的表达
IL-28A是2003年Sheppard等报道的白细胞介素,它属于干扰素λ(IFN-λ)类.IL-28主要功能有抗病毒、抗细胞增殖及免疫调节等作用.Bac-to-Bac家蚕杆状病毒表达载体系统不仅表达水平高而且对人安全,蚕蛹可药、可食,利用家蚕杆状病毒表达系统表达外源蛋白为基因工程口服药物的研发提供了可能.
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中国仓鼠卵巢细胞表达系统在疫苗研制中的应用
分子生物学、分子免疫学等学科的发展使基因工程疫苗具有越来越重要的地位.在基因工程疫苗研究的动物细胞表达系统中,具代表性的就是中国仓鼠卵巢细胞(ChineseHamster Ovary,CHO).它是用来表达外源蛋白多也成功的一类细胞.本文就CHO细胞表达系统在疫苗研制中的应用做一综述.
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噬菌体表面呈现技术及在抗寄生虫免疫中的应用
近10年来,噬菌体表面呈现技术(Phage Dislay Techniques,PDT)发展迅速,特别是在蛋白质结构研究、抗原表位分析、分子识别、细胞间信号传导、药物设计、疫苗研制、诊断试剂等方面应用广泛.Smith[1]博士于1985年首先报道小分子多肽可以在丝状噬菌体表面表达形成有活性的多肽片段.由于噬菌体易于扩增,可从含多种外源蛋白的噬菌体库中筛选出表达特异外源蛋白的噬菌体,且外源多肽或蛋白的氨基酸序列可通过测定插入噬菌体DNA序列来推测,故该技术受到许多学者的青睐.
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糖皮质激素在眼科的应用
历史回顾通过注射稀释的伤寒疫苗获得内源性皮质激素的释放,使炎症性和自体免疫性疾病的治疗取得了早期的实质性的进展.1950年,Ahrendshost和Fall描述了系统应用外源蛋白的治疗作用.并对在眼科的广泛应用提出假设[1].但是,外源蛋白所诱导的内源性皮质醇的合成表现出严重的副作用,同时伴随发热反应,不适及代谢的改变.随着促肾上腺皮质激素(ACTH)和考地松成功应用于慢性多关节炎的治疗,开始出现对眼科炎症性疾病治疗的病例报告.Elkinton等首先报道了ACTH对伴随有"一般胶原性疾病"的炎症性出血性视网膜病变的治疗作用.
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佐剂白细胞介素2对乙型肝炎病毒核酸疫苗免疫效应的影响
核酸免疫是指将编码外源蛋白的核酸表达载体直接导人机体以激发机体产生特异性免疫应答。由于核酸疫苗可诱导机体产生较强的细胞免疫应答,故有望应用于慢性病毒性感染如乙型肝炎的治疗。探讨如何增强乙型肝炎病毒核酸疫苗的免疫效应,尤其细胞免疫效应具有重要意义。为此,我们构建了编码乙型肝炎病毒(HBV,hepatitis B virus)表面抗原蛋白的重组真核表达质粒pCR3.1-S作为HBV核酸疫苗,研究了人白细胞介素2(rhIL-2,recpmbinanthuman interleukin 2)对HBV核酸疫苗诱导BALB/c小鼠产生体液和细胞免疫应答的影响,探讨了rhIL-2作为核酸疫苗佐剂的可能性。
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大肠杆菌中外源蛋白高效表达的影响因素及策略研究的新进展
大肠杆菌表达系统因为其遗传背景清楚,低成本,高生产率,特征明确,兼容多种抗体[1]使之成为目前常用的外源蛋白原核表达系统.近年来,重组大肠杆菌的高密度发酵是现代基因工程产品大规模生产的重要技术.采用高密度发酵技术,提高菌体的发酵技术,提高菌体的发酵密度,终提高产物的比生产率,不仅可以减少培养体积、优化下游分离提取,还可以缩短生产周期、降低生产成本,从而极大地提高在市场上的竞争力.然而在研究高效发酵过程中,人们往往会遇到表达效率难以得到大限度的提高与产率较低等问题.因此本文将就外源基因本身特性对于高效表达的影响,表达系统的特性对于高效表达的影响,外源基因与系统间的相互作用及其他因素等方面阐明外源基因高效表达的影响因素.终总结出一套高效表达的策略.
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乙型肝炎病毒基因免疫影响因素简述
基因免疫是近年发展起来的一种免疫策略.它是指将编码外源蛋白的基因表达载体直接导入机体以激发机体产生特异性免疫应答.自1992年Tang等率先报道以此法在小鼠体内获得成功以来[1],针对流感等疾病的基因免疫研究大量涌现.1993年以后Davis等多位学者开展了乙型肝炎病毒(HBV)基因免疫的研究.初步研究结果表明,HBV DNA疫苗能诱发机体产生特异性体液免疫、辅助T细胞(TH)增埴、细胞毒性T细胞(CTL)激活.由于其在诱生免疫应答的许多方面比合成肽等常规HBV疫苗有优势[2],应用前景可能广阔.本文仅就影响其免疫效果的因素等作一简述.
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表达外源蛋白的有利工具-毕赤酵母表达系统
巴斯得毕赤酵母(Pichiapastoris)作为80年代开发的一种表达系统,在外源蛋白的表达方面具有独特的优势,被广泛用于医药领域和科学研究.本文介绍了酵母的生物学特性、常用茵株和表达载体的特点及其研究进展,并从外源基因本身序列的内在特性和酵母发酵外源性因素两个方面,对影响外源蛋白表达的因素进行详细阐述.
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毕赤酵母高效表达外源蛋白的相关策略及研究进展
蛋白类药物和工业酶的异源表达在各类生物制药产业和工业应用中具有重要意义.巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)作为为成功的真核蛋白表达系统之一,近20年来经历飞速发展并受到广泛关注,产生了巨大的经济和社会价值.但另一方面,由于该系统受到包括外源基因本身特性、菌种特性、表达环境以及发酵工艺等在内的诸多因素的影响,其对于不同外源蛋白的表达情况也表现出较大差异.为解决这一难题,研究人员尝试使用了各种策略,如密码子优化、高拷贝菌株筛选、引导肽筛选、敲除蛋白酶基因和甘油运转体基因、共表达促折叠因子和透明颤菌血红蛋白,以及诱导条件、辅助表达物添加和发酵工艺的优化.本文对提高此系统外源蛋白表达量的相关策略及产业化研究进展进行了综述,并简要展望此系统的产业化发展前景.
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噬菌体表面呈现技术及其在原虫免疫学研究中的应用
1 概述 噬菌体表面呈现技术(Phage Display Technique,PDT)是以噬菌体为载体将外源蛋白或小分子多肽与噬菌体衣壳蛋白融合并呈现于噬菌体表面,表达的外源蛋白和多肽保持相对独立的空间结构和生物活性并且这种表达不影响噬菌体的侵染能力,因此可以被其相应的结合分子识别筛选.该技术将基因表达产物展示于噬菌体表面,在蛋白基因型和表型之间建立了联系,被广泛应用于抗原表位的分析、抗体文库的构建和筛选、多肽药物的研制、细胞间信号的转导、分子间的识别等领域,为研究疫苗和研制诊断试剂提供了崭新的模式.
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应用巴氏毕赤酵母表达基因工程药物的影响因素
巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris,Pp)表达体系是近年来刚发展起来的真核表达体系,其操作技术和酿酒酵母非常相似,相比而言Pp表达体系的应用还不够广泛,但这一体系已经显示出很好的优势和应用前景,已经成为目前分子生物学领域中用于表达重组蛋白的标准工具之一,广泛用于基因重组药物的表达.本文就采用这一表达体系表达外源蛋白所应考虑的因素进行综述.
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应用巴氏毕赤酵母高效表达基因工程药物的策略
巴氏毕赤酵母表达体系是近年发展起来的真核表达体系,具有良好的应用前景.本文综述了应用该体系高效表达外源蛋白需考虑的策略.
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不同甲醇流加策略对重组毕赤酵母发酵生产腺苷蛋氨酸的影响
目的 考察了不同甲醇流加策略对重组毕赤酵母发酵生产腺苷蛋氨酸(SAMe)的影响.方法 在发酵过程中改变甲醇浓度测定外源蛋白表达量.结果 当补加甲醇的量为0.5%时,腺苷蛋氨酸表达量高.结论 通过合适的策略控制甲醇的流加可提高外源蛋白表达量.
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利用哺乳动物细胞表达外源蛋白的研究进展
利用哺乳动物细胞表达外源蛋白已广泛应用于生物产品的制备.哺乳动物细胞是表达具有天然活性蛋白的佳宿主,且具有易被转染,遗传稳定,产物可分泌表达,并易于纯化和大规模生产等方面的优势.本文对选择载体类型、载体元件(包括启动子、增强子、选择标记等)以及在哺乳动物细胞大规模培养过程中培养环境、细胞凋亡的抑制和控制细胞增殖和基因表达的Tet-switch系统等方面的进展作一综述,以探讨提高该系统表达产量的有效方法,更好地应用于生物制品的生产.
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转基因植物口服疫苗的安全性问题所引发的思考
目前人们使用的疫苗主要是通过微生物发酵和动物细胞组织培养获得.由于其生产工序繁琐、成本高、价格昂贵,故而在需要疫苗的第三世界国家推广应用困难很大.1990年世界卫生组织(WHO)提出了"儿童疫苗计划(Children/s Vaccine Intiative Goals,CVI)",鼓励运用新技术,研究、开发和生产成本低、不用冷藏、易于使用的防病疫苗.恰值此时,以植物作为外源蛋白的生物反应器用于生产医药取得了一系列的成果.因此,当用转基因植物生产疫苗的思路被提出之后,转基因植物口服疫苗(edible vaccines produced in plants)的研究也开始蓬勃发展起来.
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巴斯德毕赤酵母表达系统
巴斯德毕赤酵母表达系统在DNA重组技术中得到越来越广泛的应用。该酵母具有独特的生物学特性,作为真核表达系统,具有严格调控外源蛋白的表达,加工修饰表达产物,表达量高,营养要求低等优点;在该表达系统中,主要有3种表达宿主菌,其载体包括整合型载体和自我复制型游离载体,其转化和表达比大肠埃希氏菌系统复杂;巴斯德毕赤酵母中表达产物可分泌至胞外,从而获得较高表达量和利于表达产物的分离纯化。