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噬菌体展示技术在病毒抗原表位筛选中的应用
病毒的抗原表位分析在揭示病毒抗原分子的结构和功能,抗原-抗体反应机制方面具有重要意义,亦为研制诊断试剂,设计多肽疫苗和筛选药物等研究提供依据.近年来,许多学者将噬菌体展示技术应用于病毒抗原表位的筛选中,结果显示:这种新型分析技术弥补了传统分析技术的不足,为基于抗原表位的后继研究奠定了基础.
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自身抗原SSA/Ro-52kD抗原优势表位分析
探讨自身抗原SSA/Ro-52kD的抗原优势表位,为疾病机制的研究提供依据.根据计算机软件进行的蛋白质序列结构分析,采用PCR法克隆自身抗原SSA/Ro-52kD多肽片段的cDNA,定向插入表达载体PGEX-5X-1,并且导入大肠杆菌中表达重组融合蛋白,用GST亲和层析柱进行纯化,经免疫印迹法与病人阳性血清进行反应.结果表明片段Ro523具有较强的抗原性.这提示SSA/Ro-52kD 的抗原优势表位主要存在于170~270位.
关键词： 自身抗原SSA/Ro-52kD 表位分析 重组抗原 免疫印迹 -
核糖体展示技术的原理与应用
通过构建分子文库(cDNA文库、随机肽库、抗体库及其它蛋白文库),采用合适的筛选技术可以非常方便、有效、快速地筛选生物活性物质.目前分子文库技术已经广泛应用于抗原表位分析、功能小肽分子(如肽类拮抗剂和激动剂)或功能蛋白分子(如抗体)的筛选和改造等领域.筛选技术主要有两类:1. 体内筛选技术,如噬菌体展示技术[1]、选择性感染噬菌体技术[2]等.
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IgE表位分析及其拮抗剂的分子设计研究进展
IgE类型的抗体是过敏性疾病的始动因素,抗IgE抗体能特异性地识别并结合游离IgE分子,下调IgE分子水平,人源化抗IgE单克隆抗体的出现更是为过敏性疾病带来了新的治疗方法.临床研究治疗哮喘、过敏性鼻炎以及食物过敏症等疾病中获得的大量数据更显示了其良好的疗效.与传统临床治疗手段相比,人源化抗IgE抗体具有副作用小,安全性高等优点.此外,治疗过敏性疾病的拮抗分子的研究也十分盛行.在分析IgE分子功能表位的基础上进行适当的分子设计可获得潜在的治疗过敏性疾病的拮抗剂如抗IgE抗体类似多肽、IgE类似肽以及其他抑制性小分子等.
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噬菌体表面呈现技术及在抗寄生虫免疫中的应用
近10年来,噬菌体表面呈现技术(Phage Dislay Techniques,PDT)发展迅速,特别是在蛋白质结构研究、抗原表位分析、分子识别、细胞间信号传导、药物设计、疫苗研制、诊断试剂等方面应用广泛.Smith[1]博士于1985年首先报道小分子多肽可以在丝状噬菌体表面表达形成有活性的多肽片段.由于噬菌体易于扩增,可从含多种外源蛋白的噬菌体库中筛选出表达特异外源蛋白的噬菌体,且外源多肽或蛋白的氨基酸序列可通过测定插入噬菌体DNA序列来推测,故该技术受到许多学者的青睐.
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自身抗原SSB/La抗原优势表位分析
目的: 探讨自身抗原La的抗原优势表位,为疾病机制的研究提供依据.方法: 根据计算机软件进行的蛋白质序列结构分析,采用PCR法克隆自身抗原La多肽片段的cDNA,定向插入表达载体PGEX-2T,并且导入大肠杆菌中表达重组融合蛋白,用GST亲合层析柱进行纯化,经免疫印迹法与患者阳性血清进行反应.结果:SSB/La的抗原优势表位主要存在于1～28,80～107,108～188,283～338位.不同病人在不同病程的La优势表位有所不同.结论: 抗原驱动机制在自身免疫疾病的发病中起重要作用, 且存在表位扩展趋势.
关键词： 自身抗原SSB/La 表位分析 重组抗原 免疫印迹 -
表面等离子共振技术分析抗A型肉毒毒素及抗破伤风毒素的单克隆抗体表位
目的 通过表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)技术对抗A型肉毒毒素(botulinum toxin A,BONT/A)及抗破伤风毒素(tetanus toxin,TT)的单克隆抗体进行抗原表位分析.方法 采用CM5芯片,通过氨基偶联抗BONT/A诊断血清,经Biacore T200捕获BONT/A,再进样抗BONT/A单克隆抗体A-13、A-14、C-5,通过响应值(response unit,RU)的变化来判断是否针对同一表位,并通过动物实验对抗BONT/A单克隆抗体进行生物学活性验证;采用CM5芯片,氨基偶联TT,经Biacore T200分别进样人源化抗TT单克隆抗体G2及G6,通过RU的变化来判断是否针对同一表位.结果 抗BONT/A的3株单克隆抗体中,单克隆抗体A-13连续3次进样后,A-14继续进样的RU略降低,C-5进样的RU明显升高,A-13+A-14、A-13+C-5、A-14+C-5组合进样的相加指数(AI)分别为35.8％、98.2％、96.0％.BONT/A剂量为2 000 LD50时,A13+ C5及A14+ C5组小鼠在96 h内均死亡1只,A13+A14组小鼠24 h内全部死亡.G2连续3针进样后,G6进样的RU升高至825.6;G6连续3针进样后,G2进样的RU升高至3 689.2.结论 A-13及A-14针对同一抗原表位,与不同表位C-5之间抗体存在协同效应;抗TT的2株单克隆抗体针对不同抗原表位.
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用合成多肽分析细粒棘球蚴AgB抗原亚单位的反应性表位
目的 通过合成多肽分析细粒棘球蚴AgB1、AgB2和AgB4等3个亚单位抗原的主要反应性表位区域.方法 用ELISA法分析来源于细粒棘球蚴AgB1、AgB2和AgB4亚单位基因序列的5个人工合成多肽KK36、RK30、B4-1、B4-2和B4-3,及上述3个亚单位重组抗原在血清抗体检测中的反应性,共检测细粒棘球蚴病(115例)、多房棘球蚴病(54例)、囊尾蚴病(22例)患者和健康人(18例)血清209份.用受试者工作特征(ROC)曲线分析合成多肽和重组抗原在血清检测中的诊断效率.结果 多肽KK36和RK30诊断细粒棘球蚴病的敏感性分别为89.2％和85.0％,特异性为62.5％和59.4％,诊断效率分别为84.8％和80.4％,与AgB1 (84.5％)和AgB2 (81.2％)抗原诊断效率相近,拟合AgB1和AgB2重组抗原的ROC曲线.来源于AgB4抗原的3个多肽B4-1、B4-2和B4-3检测细粒棘球蚴病患者血清的诊断效率分别为49.4％、57.9％和77.4％.其中,B4-3的反应性佳,B4-2也有一定的反应性.结论 KK36和RK30完整地包含了AgB1和AgB2抗原的反应性表位区域.B4-2和B4-3多肽均含有AgB4抗原的部分表位区域,推测AgB4抗原的表位区域位于序列的中后段.
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安氏隐孢子虫热休克蛋白编码基因的克隆、表达和分析
目的 克隆、表达和分析安氏隐孢子虫Mr 70000热休克蛋白(CaHSP70)的部分编码基因.方法 依据公布的CaHSP70基因序列设计引物,以江苏徐州安氏隐孢子虫(XZ-BOV)总RNA为模板,反转录PCR(RT-PCR)扩增目的编码基因.PCR产物经TA克隆后,亚克隆入pET28a原核表达载体,构建重组质粒pET28a-CaHSP70,转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并获得纯化的重组蛋白(简称为rCaHSP70).用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹(Western blotting)和ELISA对该重组蛋白进行分析和鉴定.采用相关生物信息学软件对序列进行分析.结果 根据克隆的目的基因序列推导的氨基酸序列与GenBank登录的CaHSP70一致.SDS-PAGE和Western blotting分析显示,重组蛋白(rCaHSP70)Mr约为43 000(含6个组氨酸),以包涵体的形式存在,可被辣根过氧化物酶标记的抗组氨酸抗体、安氏隐孢子虫感染的小鼠血清、微小隐孢子虫感染的儿童血清和rCaHSP70免疫小鼠血清识别.rCaHSP70存在多个功能位点和潜在的抗原决定簇.种系发生分析表明XZ-BOV与安氏隐孢子虫进化关系近.ELISA检测结果表明,rCaHSP70免疫的C57BL/6小鼠与BALB/c小鼠血清特异性抗体滴度均显著高于免疫前.结论 XZ-BOV HSP70部分编码基因的克隆获得成功,研究获得的重组蛋白具有一定的免疫原性和免疫反应性.
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结核分枝杆菌RD12区T细胞表位分布情况预测及分析
目的 预测并分析结核分枝杆菌(MTB)RD12区4个抗原的CD4+T和CD8+T细胞表位分布情况.方法 在NCBI数据库上查询并获得各个抗原的氨基酸序列,用Blast分析其与MTB复合群及人类蛋白的同源性.利用SYFPEITHI、NETCTL、BIMAS和NetMHC数据库预测并分析MTB的RDI2区抗原CD8+T细胞表位的分布情况;利用NetMHC数据库预测并分析MTB的RD12区抗原的CD4+T细胞表位的分布情况.然后,综合CD4与CD8表位预测,筛选出优势表位肽段.结果 通过预测与分析,初步筛选出MTB的RD12区4个抗原的CD8+T细胞候选表位16个;CD4+T细胞的强结合候选表位234个,弱结合候选表位505个,综合CD4与CD8表位预测并分析,终筛选出13个优势表位肽段.结论 预测出来的T细胞候选表位将为结核病的特异性诊断及新的抗结核多表位疫苗的研究奠定基础.
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mHSP70分子中免疫刺激肽段与CD40对接复合物的结构模拟
微生物体内的70 ku热休克蛋白407-426片段可以有效刺激体内CD40+抗原递呈细胞如DC,单核细胞等的成熟,可有效刺激体内产生IL12和TNFα,被认为是CD40L的替代配体,因此对免疫系统有着重要的意义.同时,该片段还可以有效结合外源蛋白分子,因此又是天然的递呈抗原的载体佐剂.该文章以开发新型载体佐剂为目的,使用Discovery studio软件分析经过单片段与两次串联的该肽段结构并预测了它们与CD40分子进行对接后的复合物.经过分析其关键结合位点,阐明了该肽段与CD40分子间参与相互作用的残基,并发现经过2次串联的肽段确实可以比单片段更有效的与CD40进行相互作用.因此,实验结果可为新型肿瘤疫苗的设计提供理论依据.
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紫外线致弱尾蚴免疫兔血清筛选日本血吸虫童虫cDNA文库
目的 筛选紫外线致弱尾蚴中起免疫保护作用的抗原分子,分析其主要表位,为血吸虫病疫苗研究提供新的候选抗原.方法 以紫外线照射致弱尾蚴免疫兔血清筛选日本血吸虫童虫cDNA文库,对阳性克隆插入片段的核苷酸进行序列分析,并利用软件Antheprot对所筛基因编码的抗原分子进行表位预测.结果 经三轮筛选,共获20个阳性克隆,序列同源性分析表明其中有5种已知基因(GST、副肌球蛋白、肌球蛋白、钙离子激活蛋白和3-磷酸甘油醛脱氢酶),6种未知基因,软件分析显示不同抗原分子分别具有多个不同的抗原表位.结论 获得的阳性克隆插入基因片段可能为潜在的日本血吸虫病疫苗分子,可能是多抗原、多表位在照射致弱尾蚴中起免疫保护作用.
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基于抗原表位分析的人乳头瘤病毒16 L1壳蛋白基因克隆及表达纯化
目的：：选择人乳头瘤病毒(HPV)16L1抗原性强的一段抗原表位编码区,构建原核表达载体并利用大肠杆菌表达抗原蛋白,为HPV疫苗的研究及宫颈癌的诊断奠定基础。方法：借助DNAstar软件分析HPV16L1的CDS区,选择抗原性强的一段抗原表位编码区,提取HPV16L1编码区的DNA。目的DNA和pET32a质粒分别进行双酶切,连接并转化DH5α大肠杆菌,筛选阳性克隆后转化BL21大肠杆菌,诱导产生HPV16L1重组蛋白,通过市售抗体对重组蛋白的抗原特异性进行鉴定。结果：利用DNAstar软件,选择了抗原表位较富集的碱基序列919~1314bp区段,按常规制备重组蛋白的方法成功制备HPV16L1重组蛋白。抗体鉴定表明,制备的重组蛋白抗原特异性良好。结论：有针对性地制备HPV16L1重组蛋白,可避免其他抗原表位的干扰。经鉴定,HPV16L1重组蛋白抗原特异性良好,将为HPV疫苗的研究及宫颈癌的诊断奠定基础。
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肝癌相关的单克隆抗体的制备及其抗原表位分析
目的:制备肝癌相关的单克隆抗体(mAb)用于肝癌的诊断.方法:用高转移肝癌细胞系HCCLM-6细胞免疫BALB/c小鼠后,取小鼠脾细胞与Sp2/0融合建立杂交瘤细胞系.通过ELISA法筛选HCCLM-6细胞蛋白的特异性mAb,用免疫组化染色法筛查对肝癌组织阳性率高的mAb,并用免疫荧光方法鉴定其在不同肿瘤细胞系中的表达,后通过筛选Uni-ZAP XR人肝细胞cDNA表达文库初步鉴定mAb识别的抗原及其表位.结果:建立了28株杂交瘤细胞株,用ELISA法和免疫组化染色法筛选出肝癌阳性率较高的mAbQGA062.通过人肝细胞cDNA表达文库筛选初步鉴定表明mAb QGA062识别的抗原是纤维连接蛋白(FN),经分析其抗原表位位于肽段YTVSLVAIKGNQESPK.结论:获得与肝癌相关的mAb QGA062,并鉴定了其识别的抗原和表位,为肝癌的诊断和FN参与肝癌转移的机制研究提供了重要的制剂.
