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脊髓灰质炎病毒载体研究进展
脊髓灰质炎病毒是小核糖核酸病毒科成员,是单正链RNA病毒.从上世纪八十年代以来,人们一直致力于发展脊髓灰质炎病毒载体,先后出现了抗原嵌合载体、PV复制子、多聚蛋白融合载体及双表达载体等类型.近年,脊髓灰质炎病毒载体用于在中枢神经系统中定点表达外源蛋白,引起了人们的重视.本文对脊髓灰质炎病毒载体的类型、特点、应用及新进展作一综述.
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双顺反子载体构建及其在基因联合免疫中的应用
目的为了便于多价DNA疫苗的制备和基因表达的研究.方法以pcDNA3.0为基础构建了pcDNA3.0BA双顺反子载体,将HBV preS2S与HCV pc154基因插入pcDNA3.0BA构建了单价和双价质粒.质粒转染Cos-7细胞瞬时表达,并经肌肉免疫BALB/c小鼠测定抗体应答和淋巴细胞增殖能力.结果pcDNA3.0BA全长为6.4kb,具有两个外源基因表达单元,其调控元件均为CMV启动子和BGH pol A;两个表达单元中多克隆位点单酶切分别为:MCS1为EcoRⅤ、Not Ⅰ、Xho Ⅰ;MCS2为:Kpn Ⅰ、BamHⅠ、EcoRⅠ.双价质粒在Cos-7细胞中preS2S与HCV pc154两个基因都同时表达,诱导小鼠产生了抗HBs和HCV核心蛋白抗体,抗体效价和淋巴细胞对抗原刺激的增殖能力单价和双价质粒相比差异不显著.结论pcDNA3.0BA双顺反子载体可以共表达多个基因,并诱导产生免疫应答.
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用IRES及dhfr构建哺乳动物细胞双表达载体
目的:构建同时表达抗体的重链和轻链的哺乳动物细胞双表达载体.方法:将微小RNA病毒内部核糖体进入位点(IRES),亚克隆到质粒载体pCdhfr1多克隆位点,构建了哺乳动物细胞双表达载体pCdhfr5.结果:pCdhfr5具有两处多克隆位点, 由IRES相连.能同时表达两个外源基因.把绿色荧光蛋白基因和新霉素磷酸转移酶基因分别亚克隆到pCdhfr5的上下游多克隆位点MCS1和MCS2构建了表达质粒pFN, 经脂质体法转染CHO细胞,筛选到同时表达新霉素磷酸转移酶和绿色荧光蛋白的表达株.结论:双表达载体的构建成功为进一步研究表达抗体全分子的CHO细胞株奠定了基础.
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乙型肝炎病毒核心抗原及Flt3配体双表达核酸疫苗的构建与体外表达
目的:构建可同时表达乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)和Flt3配体(FL)胞外段的双表达核酸疫苗.方法:将HBcAg和FL胞外段的基因用PCR方法扩增并分别引入相应的限制性内切酶酶切位点,然后克隆入真核双表达载体pIRES,获得含双基因片段的表达质粒;再取该表达质粒中的内部核糖体切入位点(IRES)序列和基因片段克隆入pJW4303载体中,获得相应的双表达核酸疫苗,经筛选鉴定后,以293T细胞瞬时表达检测两基因的表达水平.结果:构建成功以pIRES、pJW4303为载体的4种HBcAg和FL胞外段的双表达核酸疫苗,体外表达证实HBcAg和FL胞外段均能高效表达,基因位于IRES上游时表达水平较高.结论:用IRES元件实现了HBcAg和FL胞外段双表达核酸疫苗的构建,pJW4303为载体的核酸疫苗两基因表达水平优于pIRES为载体的核酸疫苗.
关键词： 乙型肝炎病毒核心抗原 Flt3配体 双表达载体 核酸疫苗 -
真核双基因表达载体pBud-TRAIL-IL-24的构建及其在宫颈癌细胞中的表达
目的:构建肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL)基因和白细胞介素24( Interleutin-24,IL-24)基因的真核双基因表达载体,并观察其对宫颈癌细胞生长的影响情况.方法:采用分子克隆技术,将IL-24基因插入真核表达载体pBud-TRAIL中,构建双表达质粒pBud-TRAIL-IL-24,经酶切和测序鉴定后,转染宫颈癌HeLa细胞.荧光显微镜和免疫荧光双标技术检测TRAIL和IL-24在HeLa细胞中的表达.MTr法检测重组质粒对HeLa细胞生长状况的影响.结果:成功构建了真核双基因表达载体pBud-TRAIL-IL-24,并在宫颈癌细胞中表达；转染48 h后可见重组质粒对宫颈癌细胞生长有明显抑制作用(P＜0.05).结论:构建的双表达载体pBud-TRAIL-IL-24能在宫颈癌细胞中表达,并可有效抑制宫颈癌HeLa细胞增殖,为进一步研究TRAIL和IL-24联合应用于宫颈癌的基因治疗奠定了基础.
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HLA-DRB1*0901及HLA-DRA基因真核细胞双表达载体的构建及鉴定
目的 构建HLA-DRB1*0901及HLA-DRA基因真核细胞双表达载体,并对其是否表达鉴定.方法 用RT-PCR的方法从人外周血淋巴细胞的mRNA中逆转录扩增出HIA-DRB1*0901和HLA-DRA的cDNA,HLA-DRA经BglⅡ酶切插入真核表达载体pVITRO2的MCS2中,同时确认正反向,再在pVITR02的MCS1中连入BamH I酶切的HLA-DRB,确认正反向.将舣表达载体转染猪肾细胞,Western-blotting鉴定是否表达.结果 酶切和PCR分析鉴定,得到了pVITRO2-DRA-DRB1*0901双表达载体,Western-blotting鉴定出有表达.结论 双表达载体pVITRO2可以在猪肾细胞中表达HLA-DRBI*0901.
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双表达载体研究GM-CSF对HCV C基因免疫应答的影响
目的 HCV C蛋白基因诱导的免疫应答较弱,因而增强HCV C蛋白基因免疫对于开发HCV疫苗具有极其的重要性.方法将GM-CSF基因与pc154基因插入双表达载体pcDNA3.0 BA构建成双价质粒pcDNA3.0 BApc154GM-CSF,肌肉免疫Balb c小鼠.结果 GM-CSF和pc154在Cos-7细胞中同时获得瞬时表达;pcDNA3.0 BApc154GM-CSF双价质粒较单价pcDNA3.0 BApc154诱导小鼠产生抗体的几何平均滴度显著增高(P=0.04),而pcDNA3.0 BApc154+pcDNA3.0BAGMCSF混合质粒较单价质粒pcDNA3.0BApc154诱导小鼠产生抗体的滴度极显著降低(P＜0.01).HCV C蛋白抗原特异性的脾淋巴细胞增殖能力,双价质粒较单价及单价混合质粒极显著增高(P＜0.01).结论双表达载体同时输送GM-CSF与pc154基因能增强Balb/c小鼠对HCV C蛋白基因的体液免疫应答及免疫鼠脾淋巴细胞对特异性抗原刺激的增殖能力.
