磷酸酯酶抑制剂冈田酸对HepG2.2.15细胞中乙型肝炎病毒复制的影响

目的 初步鉴定可能与HBV核心蛋白去磷酸化有关的磷酸酯酶.方法 以磷酸酯酶2A抑制剂冈田酸(OA)处理体外培养的人肝癌HepG2.2.15细胞.将细胞分为4组,分别加入终浓度为0(对照组)、10、20、30ng/ml的OA(OA 10 ng组、OA 20 ng组、OA 30 ng组),每组各设5孔.在培养0、2、4、6 d时分别收集各组细胞培养上清液,采用电化学发光方法检测HBsAg浓度,荧光实时定量PCR方法检测HBV DNA拷贝数.取培养2d时的各组细胞,采用蛋白质印迹方法检测HBcAg异质性,免疫荧光细胞化学染色方法检测HBcAg亚细胞定位.结果 OA 10ng组、OA 20 ng组各时间点细胞培养上清液HBsAg浓度、HBV DNA拷贝数分别与对照组相应各时间点比较,差异均无统计学意义;在培养2 d时HBcAg电泳条带、亚细胞定位分别与对照组比较均无明显异常.OA30 ng组在培养2、4、6 d时细胞培养上清液HBsAg浓度(ng/ml)均明显低于对照组相应各时间点(分别为385.9±43.1 vs 510.2±63.3、346.5±39.6 vs 484.6±59.4、295.1±32.8 vs 467.2±52.9,P值分别为0.028、0.022、0.016);在培养2 d时细胞培养上清液HBV DNA拷贝数(ml-1)明显高于对照组相应时间点(6.71±6.07 vs 6.34±5.72,P=0.022),而在培养4、6 d时均明显低于对照组相应各时间点(分另为5.80±5.19 vs 6.29±5.68、4.75±4.15 vs 6.25±5.58,P值分别为0.008和0.005);在培养2 d时HBcAg电泳条带明显增宽,约20%的HepG2.2.15细胞的细胞核内HBcAg红色荧光信号明显增强.结论 短时间、高浓度的OA处理可提高HBV DNA的复制水平和核心蛋白的磷酸化水平,提示磷酸酯酶2A可能参与了HBV核心蛋白的去磷酸化过程.

双顺反子载体构建及其在基因联合免疫中的应用

目的为了便于多价DNA疫苗的制备和基因表达的研究.方法以pcDNA3.0为基础构建了pcDNA3.0BA双顺反子载体,将HBV preS2S与HCV pc154基因插入pcDNA3.0BA构建了单价和双价质粒.质粒转染Cos-7细胞瞬时表达,并经肌肉免疫BALB/c小鼠测定抗体应答和淋巴细胞增殖能力.结果pcDNA3.0BA全长为6.4kb,具有两个外源基因表达单元,其调控元件均为CMV启动子和BGH pol A;两个表达单元中多克隆位点单酶切分别为:MCS1为EcoRⅤ、Not Ⅰ、Xho Ⅰ;MCS2为:Kpn Ⅰ、BamHⅠ、EcoRⅠ.双价质粒在Cos-7细胞中preS2S与HCV pc154两个基因都同时表达,诱导小鼠产生了抗HBs和HCV核心蛋白抗体,抗体效价和淋巴细胞对抗原刺激的增殖能力单价和双价质粒相比差异不显著.结论pcDNA3.0BA双顺反子载体可以共表达多个基因,并诱导产生免疫应答.

抗HBc IgM阳性慢性乙型肝炎临床特性、病毒学和血清学研究

目的 探讨抗HBcAg IgM阳性慢性阳性肝炎患者的临床特性及其与HBV病毒学和血清学的关系.方法 收集河北省张家口市传染病医院和北京地坛医院2004-2006年经Abbott EIA检测试剂证实的所有抗HBcAg IgM阳性和同期随机抽样的抗HBcAg IgM阴性患者的临床资料,包括生化指标、血清HBV DNA载量和血清学指标,分析抗HBcAg IgM阳性和阴性患者的疾病程度和临床转归之间的差异及抗HBcAg IgM状态与HBV DNA载量和HBeAg状态的关系.结果 收集了200例慢性乙型肝炎患者,其中抗HBc IgM阳性70例,阴性130例,轻、中和重度肝脏疾病患者分别为71、83、46例.抗HBc IgM阳性患者的年龄和发病年数高于抗HBc IgM阴性患者,抗HBc IgM阳性的轻度肝脏疾病患者百分比为45.71%,中重度患者为54.29%,低于抗HBc IgM阴性患者(30.00%和70.00%),差异有统计学意义(x2=4.907,P=0.027).抗HBc IgM阳性患者和阴性患者的HBV DNA载量,血清HBeAg/抗Hbe状态、住院天数和转归差异无统计学意义.结论 慢性乙型肝炎患者抗HBcAg IgM的状态与肝脏疾病的程度相关,但与HBV DNA载量和HBeAg/抗Hbe状态无相关性.

血清HBsAg阳性IgA肾病肾组织HBV抗原蛋白及血清和肾组织HBV-DNA检测分析

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)感染与IgA肾病发病的关系.方法 32例肾活检冰冻切片组织HBsAg和HBcAg蛋白和42例HBsAg阳性的肾活检石蜡切片组织及其部分血清HBV-DNA的检测.结果 HBsAg和HBcAg在IgA肾病肾活检组织的总阳性率为59.1%,在非IgA肾病中的总阳性率为63.6%,二者差异无统计学意义.42例肾活检组织中,仅发现有5例(11.9%)在肾活检组织中有HBV-DNA的存在.且5例均为大三阳患者,其病理诊断为系膜增生性肾小球肾炎2例,轻微肾小球病变1例,基底膜病变1例,IgA肾病仅1例.血清HBsAg阳性的患者,同时进行了42例肾活检组织的血清HBV-DNA检测,其中大三阳患者为12例,其血清HBV-DNA均为阳性,而这12例血清阳性的肾活检组织中仅有5例HBV-DNA为阳性,其余30例血清及肾活检组织中HBV-DNA为阴性.结论 HBsAg和HBcAg蛋白在IgA肾病肾活检组织和非IgA肾病肾活检组织表达差异无统计学意义,表明HBV感染与IgA肾病并无直接关系.

C基因截短的HBV复制与包装

目的探讨C基因截短型HBV变异体的复制与包装.方法采用分子克隆、人工定点突变等技术构建C基因截短型HBV变异体质粒,用脂质体法转染HepG2细胞,提取细胞内及培养上清液中DNA分别进行Southern杂交,PCR及实时定量荧光PCR分析.结果经DNA测序及酶切鉴定证实C基因截短型HBV质粒载体构建成功;C基因截短型HBV为复制缺损型,与辅助质粒共转染HepG2细胞,可在细胞内及培养上清液中检测到HBV各种DNA构型;DNA定量分析提示C基因截短型HBV的包装效率较野生型HBV提高3～40倍.结论C基因截短型HBV变异体为复制缺损型,单独转染后不能在肝细胞内包装与复制,但在缺失包装信号ε的相应辅助病毒辅助下可有效复制并包装成子代病毒颗粒分泌到胞外,且包装效率大大提高.

乙型肝炎病毒C蛋白对NK细胞功能影响的体外研究

目的 研究乙型肝炎病毒C蛋白在NK细胞中的表达及其对NK细胞功能的影响.方法 用脂质体转染法将HBV C基因真核表达载体pHBI-CMV-HBC转入NK-92细胞,通过WesternBlot检测C基因在NK-92细胞中表达,用ELISA法检测NK细胞分泌IFN-γ水平,MTT法检测NK细胞对HepG2细胞的细胞毒作用.结果 Western Blot证实转染有pHBI-CMV-HBC的NK-92细胞能表达HBV C蛋白.转染了重组真核表达质粒的NK-92细胞IFN-γ水平均高于空质粒对照组和空白对照组(P<0.01).与两对照组相比,重组真核表达质粒转染组NK-92细胞对于HepG2细胞的细胞毒活性明显提高,差异具有统计学意义(P<0.01).结论 HBc基因瞬时高表达可影响NK-92细胞分泌IFN-γ和细胞毒功能.

丙型肝炎病毒核心抗原在静脉吸毒者血清中的检测

目的 调查丙型肝炎病毒核心抗原(HCVcAg)在静脉吸毒者血清中的检出状况。方法 对93例静脉吸毒者血清同时进行HCVcAg、HCV RNA定量、抗HCV IgG、HBsAg检测，分析HCVcAg检出率与HCV RNA定量及合并HBV感染之间的关系。结果 在93例静脉吸毒者中，抗HCV IgG阳性79例,HCV RNA阳性68例,HCVcAg阳性37例。以HCV RNA作比较，HCVcAg检测的特异性和敏感性分别是100％和54％；HCVcAg检出率与HCV RNA载量对数值呈正相关,r=0.958，P=0.010;HCV RNA阳性静脉吸毒者中，HBsAg阳性和HBsAg阴性时HCVcAg的检出率分别为38％和69％，两者比较P＜0.01;2例抗HCV IgG阴性、HCV RNA阳性静脉吸毒者，HCVcAg检测呈阳性。结论 HCVcAg在静脉吸毒者血清中检测其特异性好，而敏感性较差；HCVcAg的检出率与HCV RNA载量的对数呈正相关；在静脉吸毒者，合并HBV感染可能是血清HCVcAg检测的干扰因素，可能是HBV抑制了HCVcAg的表达。

携带HSP70-HBsAg嵌合基因复制缺陷型重组腺病毒的制备

目的 构建表达乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和热休克蛋白70(HSPT0)嵌合基因的复制缺陷型重组腺病毒载体.方法扩增结核分枝杆菌HSP70基因片段,亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV-HBsAg上,与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共同电转化到大肠埃希菌BJ5183内进行同源重组,经卡那霉素抗性筛选和酶切鉴定筛选出携带HBsAg-HSP70嵌合基因的重组腺病毒载体,用脂质体包裹Pac Ⅰ酶切线性化的重组质粒,转染到293细胞内进行重组腺病毒的包装.体外转染真核细胞,通过示踪基因绿色荧光蛋白表达的观察、RT-PCR和ELISA检测目的基因的表达.结果成功获得重组腺病毒质粒pAd-HBsAg-HSP70.重组质粒pAd-HBsAg-HSP70导入293细胞,经包装和二次扩大培养获得了具有感染能力的重组腺病毒颗粒Ad-HBsAg-HSP70,其病毒滴度达2×1012pfu/L,并能在真核细胞中有效表达目的基因.结论成功构建表达HBsAg-HSP70复制缺陷型重组腺病毒载体,为进一步开展HBV基因治疗研究提供实验基础.

酶联免疫吸附试验检测乙肝核心抗体假阳性分析

目的 对酶联免疫吸附试验(ELISA)检测乙肝核心抗体(抗HBc)的假阳性分析.方法 ELISA法采用的是竞争抑制法检测抗HBc;化学发光微粒子免疫测定法(CMIA)检测抗HBc.结果 用ELISA法初检210份标本,其中抗HBc高值80例、抗HBc低值130例,在抗HBc低值组中,ELISA法、CMIA法复检的阳性率分别为46.1％、15.4％,三者之间差异都有统计学意义(P均＜0.01),两对半模式主要以2、5阳和5阳为主.结论 用ELISA法初检时,当抗HBc值处在低值时,两对半模式为2、5或5阳时,应对标本用ELISA法复检,甚至用CMIA法重测,以确保结果的准确性.

加样时间差异对酶免疫竞争法检测抗-HBc结果的影响

酶免疫竞争法是检测乙型肝炎(乙肝)病毒核心抗体(抗-HBc)普遍的方法,其方法不断改进,反应时间大为缩短,在成批样本测定时,常导致出现前后结果不一问题.对此进行如下分析.

HBV血清标记物不同组合模式与荧光定量结果之间的关系

目的:对HBV血清标记物不同组合模式与HBV-DNA定量结果进行对比分析.方法:采用ELISA方法检测乙肝病毒血清标记物,荧光定量PCR检测HBV-DNA,比较二者关系.结果:HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性组、HBsAg、HBeAg阳性组及HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBcAb阳性组HBV-DNA检出率和平均水平含量均较高.结论:荧光定量PCR检测HBV-DNA能准确反映体内HBV真实感染和复制情况,同时进行HBV血清标记物的检测与HBV-DNA荧光定量PCR的检测,更有利于HBV临床感染上的诊断、对治疗方案的选择及疗效评价.

乙型肝炎病毒核心基因在毕赤酵母中的表达及表达产物在乙型肝炎病毒核心抗体检测中的应用评价

目的在毕赤酵母中表达出高免疫反应性和特异性的重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg),探讨该表达产物在乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)免疫检测中的应用.方法用PCR从含有乙型肝炎病毒DNA模板的质粒中扩增出编码HBcAg 的C基因,插入pPIC9酵母表达载体.携带有C片段的pPIC9转化毕赤酵母菌株GS115,经甲醇诱导表达HBcAg.分别用分子筛纯化毕赤酵母表达的HBcAg(A)、单克隆HBcAb特异结合纯化毕赤表达的HBcAg(B)、分子筛纯化大肠杆菌表达的HBcAg(C)、单克隆HBcAb特异结合纯化大肠杆菌表达的HBcAg(D)作为固相抗原,辣根过氧化物酶标记多克隆HBcAb为探测抗体,用竞争抑制法酶联免疫吸附测定(competitive inhibition ELISA)检测HBcAb标准品及含有乙型肝炎病毒PCR阳性和阴性血清的临床标本.结果聚丙烯酰胺凝胶电泳、immunoblot、ELISA显示HBcAg在毕赤酵母中高效表达;分别用抗原A、B、C、D制备的试剂检测中国药品生物制品检定所HBcAb国家参考品:试剂A与B结果相同: 阴性符合率(-/-)15/15,阳性符合率(+/+)15/15;低检出量(稀释度):灵敏度参考品?=1∶ 128,3#=1∶ 16,4#=1∶ 64.试剂C与D结果相同:阴性符合率(-/-)15/15;阳性符合率(+/+)14/15;低检出量(稀释度):灵敏度参考品2#=1∶ 32;3#=1∶ 16;4#=1∶ 32;大肠杆菌抗原的灵敏度明显低于毕赤酵母抗原.对乙型肝炎病毒PCR阳性及阴性的临床标本进行检测,结果如下: PCR阳性组HBcAb阳性检出率:试剂A 97.8%; 试剂B 98.1%;试剂C 96.6%;试剂D 91.4%;A、B、C三组间比较差异无统计学意义(P＞0.05);D分别与A、B、C相比较差异均有统计学意义(P＜0.005).PCR阴性组HBcAb阴性检出率:试剂A 80.3%;试剂B 80.9%;试剂C 75.0%;试剂D 85.7%;AB两组比较差异无统计学意义(P＞0.05); AC、AD、BC,BD、CD相比较差异均有统计学意义(P＜0.005);分子筛纯化的大肠杆菌HBcAg含有干扰检测的杂质,结果出现假阳性;大肠杆菌HBcAg存在表位缺失导致结果出现假阴性.结论毕赤酵母表达系统高效表达出具有良好免疫反应性和特异性的HBcAg,用于HBcAb的检测灵敏度及特异性均优于大肠杆菌表达产物.

为什么要选用要求标本1∶1 000倍稀释的抗乙型肝炎核心抗原IgM试剂盒?

血清HBcAg和HBsAg/IgM在慢性乙型肝炎患者中的意义

我们应用放射免疫分析法(RIA),测定638例慢性乙型肝炎患者,108例"健康"成人的血清中乙型肝炎核心抗原(HBcAg)与乙型肝炎患者表面抗原/免疫球蛋白复合物(HBsAg/IgM).现将两项检测指标的临床意义报告如下.

乙型肝炎病毒表面抗原阳性患者前-S1抗原和前-S2抗原与HBVDNA和HBV-M相关性分析

目的 检测乙型肝炎病毒患者乙型肝炎病毒前-S1抗原(HBV pre-S1-Ag)、前-S2抗原(HBVpre-S2-Ag)、乙型肝炎病毒DNA(HBV DNA)和乙型肝炎病毒E抗原(HBeAg),探讨其相关性和临床应用价值.方法 应用酶联免疫测定法(ELISA)分别检测HBV pre-S1-Ag、HBV pre-S2-Ag和乙型肝炎病毒标志物(HBV-M),荧光定量聚合酶链反应法(FQ-PCR)检测HBV DNA,并对检测结果进行统计学分析.结果HBsAg阳性者中,pre-S1-Ag、pre-S2-Ag、HBV DNA阳性者分别为594例、541例、629例,其阳性率分别为66.29%、60.38%、70.20%.HBeAg阳性组pre-S1-Ag、pre-S2-Ag、HBV DNA的阳性率分别为90.21%、74.46%、93.32%,显著高于HBeAg阴性组的45.28%、48.01%、49.89%,差异有统计学意义(P<0.01).随着HBV DNA载量的增高,pre-S1-Ag、pre-S2-Ag、HBeAg阳性率随之增高.结论pre-S1-Ag、pre-S2-Ag与HBV DNA和HBeAg阳性检出率具有显著相关性.联合检测pre-S1-Ag、pre-S2-Ag、HBV DNA及HBV-M,有助于HBV早期诊断、疗效观察和预后判断.

慢性乙型肝炎病毒感染者994例肝组织HBsAg和HBcAg表达强度的临床意义

目的 分析慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者肝组织HBsAg和HBcAg的表达强度及临床意义.方法 收集994例接受肝脏穿刺活检术及组织病理学检查的慢性HBV感染者的临床资料,根据乙型肝炎e抗原(HBeAg)及HBV DNA水平分为HBeAg(+)/HBV DNA(+)组、HBeAg(-)/HBV DNA(+)组及HBeAg(-)/HBV DNA(-)组;根据肝组织HBsAg和HBcAg免疫组织化学染色分为阳性组和阴性组;根据丙氨酸转氨酶(A LT)的水平分为＜2×正常值上限(ULN)组、2～＜5×ULN组及≥5×ULN组.研究肝组织炎症活动度(A)、纤维化分期(F)及肝组织HBsAg和HBcAg的表达强度,分析其与临床特征的相关性.Logistic回归分析影响肝组织HBsAg和HBcAg表达强度的相关因素.结果 994例慢性HBV感染者中,肝组织HBsAg染色阳性941例(94.67％),肝组织HBcAg染色阳性553例(55.63％);≥A2者403例(40.85％),≥F2者371例(36.09％).HBeAg(-)/HBV DNA(+)组的A和F严重,其次为HBeAg(-)/HBV DNA(-)组,HBeAg(+)/HBVDNA(+)组低;虽然三组间肝组织HBsAg染色强度的总体差异有统计学意义(x2=6.299,r=-0.760,P＜0.05),但两两比较差异均无统计学意义;三组间肝组织HBcAg染色强度的总体差异有统计学意义(x2=282.995,r=-0.645,P＜0.01),以HBeAg(+)/HBV DNA(+)组高、HBeAg(-)/HBV DNA(-)组低.肝组织HBsAg染色阳性组HBeAg阳性的构成及HBV DNA平均水平均高于阴性组,年龄低于阴性组;肝组织HBcAg染色阳性组HBeAg阳性的构成、ALT、天门冬氨酸转氨酶(AST)、血小板(PLT)及HBV DNA平均水平均高于阴性组,年龄及FIB-4低于阴性组;影响肝组织HBsAg染色的因素为HBV DNA水平;影响肝组织HBcAg染色的因素为HBeAg阳性及HBV DNA水平.肝组织HBsAg不同染色强度间A和F的总体差异均无统计学意义(x2=1.943和2.630,P值均＞0.05);肝组织HBcAg不同染色强度间A的总体差异无统计学意义,而F的总体差异有统计学意义(x2=12.352,P＜0.01),以阴性组的F严重.ALT不同水平组肝组织HBsA染色强度的差异无统计学意义;肝组织HBcAg染色强度的差异有统计学意义(x2=16.349,P＜0.01),ALT＜2×ULN组均低于其他组.结论 慢性HBV感染者中绝大数肝组织HBsAg染色阳性,超过半数肝组织HBcAg染色阳性;肝组织HBsAg的表达强度与A和F无相关性,与HBV DNA水平正相关;肝组织HBcAg的表达强度与A无相关性,与F负相关,与HBeAg阳性、HBV DNA及ALT水平正相关.

乙肝病毒相关的慢性肝病中病毒血清标志物状态分析

目的 调查分析乙肝病毒(HBV)相关的慢性肝病(CLD)[包括慢性乙型肝炎(CHB)、肝硬化(LC)、肝细胞癌(HCC)]中HBV血清标志物不同状态的构成比及其临床意义.方法 对2006年1月-2007年12月于广州南方医院住院的2482例CLD患者的临床资料进行统计分析.结果 1226例CHB中,HBeAg阳性、HBeAg阴性的病例分别占64.4%、35.6%;362例LC和894例HOC中,HBeAg阳性、HBeAg阴性、HBsAg阴性的病例分别占27.1%、66.0%、6.9%和16.4%、75.1%、8.5%.对每一种CLD而言,血清标志物不同状态的男女构成比无显著差异;HCC的男女比值显著高于CHB和LC.CHB中,HBeAg阴性患者的平均年龄显著高于HBeAg阳性者;而LC、HCC中,不同血清标志物状态的患者平均年龄均无显著性差异.HBeAg阴性与HBeAg阳性的CHB病例中,丙氨酸转氨酶(ALT)各区段构成比无显著性差异;而在LC、HCC中,随着HBeag阳性、HBeAg阴性、HBsAg阴性方向的变迁,ALT低水平区段的构成比均逐渐增加.结论 HBV血清标志物状态在慢性肝病中存在着不同的构成比并具有相应的临床意义.

乙型肝炎病毒核心抗原与金属硫蛋白相互作用的研究

探讨乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)在乙型肝炎发病机制中的作用,寻找防治乙型肝炎病毒(HBV)感染的有效方法.应用改进的酵母双杂交技术构建HBcAg诱饵质粒,转化酵母细胞AH109后,与含肝文库质粒的酵母Y187进行配合、双杂交,经营养缺陷培养基(SD/-Trp-Leu-His-Ade)及X-gal双重筛选,获得真阳性菌落16个,PCR扩增出靶基因,测序后进行生物信息学分析,发现其中含金属硫蛋白基因的菌落有2个.进一步用网织红细胞裂解物体外翻译、蛋白间免疫共沉淀实验证实,金属硫蛋白与HBcAg间有确切的结合作用.推测金属硫蛋白在HBV的致病过程中起着重要作用.

探讨HER-2/neu基因与乙肝病毒及预后的关系

目的:探讨45例肝细胞癌(HCC)患者的癌及癌旁组织中,HER-2/neu基因、HBsAg、HBcAg的表达情况.方法:分别用SP法进行免疫组织化学染色,将结果进行统计学处理.结果:HER-2/neu、HBsAg在肝癌中的表达低于癌旁组织(χ2分别为22.77和15.65,P＜0.01),HBcAg在肝癌及癌旁中的表达差异无统计学意义(χ2=-2.70,P＞0.05).HER-2/neu基因癌组织阳性率与HBsAg、HBcAg均存在关联性(χ2分别为17.78和8.46,r分别为0.532和0.398).而癌旁组织阳性率与HBsAg有关联性(χ2=15.33,r=0.254),与HBcAg不存在关联性(x2=0.126 7,P＞0.05).HER-2/neu基因癌组织阳性组(7例)中HBsAg阳性率高于阴性组(χ2=12.69,P＜0.01),HBcAg阳性率也高于阴性组(χ2=5.08,P＜0.05).HER-2/neu基因癌旁组织阳性组(39例),HBsAg阳性率明显高于阴性组(χ2=11.84,P＜0.05).在临床分期(1989年日本分期)中,各组间差别均无统计学意义.结论:HER-2/neu基因阳性时,HBsAg、HBcAg的阳性率均明显升高.在临床分期中,随着癌组织的进展,癌旁HER-2/neu基因的表达有降低的趋势.

慢性乙型肝炎G1～G2级患者临床与病理分析

我国属慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染高发区,慢性乙型肝炎作为导致慢性肝脏疾病常见的原因,正严重危及公众健康.