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慢性乙型肝炎患者血清 HBV －DNA 水平与外周血自然杀伤细胞的相关性分析
目的：分析慢性乙型肝炎患者血清乙型肝炎病毒（HBV）复制程度与外周血中自然杀伤（NK）细胞的免疫功能关系。方法收集筛选适合研究的慢性乙型肝炎患者，分别于治疗前后静脉血，分离淋巴细胞液，荧光标记的 CD56＋、CD16＋单克隆抗体染色，流式细胞仪测定 NK 亚群细胞数量及抽取百分比；荧光定量聚合酶链反应（PCR）法检测 HBV DNA 水平；取青年健康者作空白对照，比较治疗前、后各组数据。结果15例患者治疗后 NK 细胞有显著增高（P ＜0.05），且均低于正常对照组。同时治疗前 HBV DNA 中低拷贝数治疗后CD56＋CD16－亚群、CD56＋CD16＋亚群变化明显。结论NK 细胞检测有助于评价慢性乙型肝炎抗病毒治疗转归和内在免疫功能变化。
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微小染色体维持蛋白与肿瘤
微小染色体维持基因(Mcm)编码的6个Mcm蛋白(Mcm2-7)在DNA复制的起始和延伸过程中起着十分关键的作用,它确保DNA的复制在每个细胞周期仅发生一次.Mcm蛋白的检测在肿瘤的诊断、预后评价、临床治疗等方面具有重要的应用前景.本文就有关Mcm蛋白的组成、作用、相互关系、调控及其在正常和肿瘤组织中表达的意义方面作一介绍.
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反复冻融对血清HBV DNA定量检测结果的影响
目的 研究反复冻融对血清 HBV DNA 定量检测结果的影响.方法 采集 15 例慢性乙型肝炎患者静脉血,离心后获得血清标本.将各血清标本于-20℃保存 24h,室温解冻 1h,完成第 1 次冻融循环,此后按相同步骤依次进行第2～6 次冻融循环.第 1 次冻融循环前 (第 0 次冻融循环) 和每次冻融循环后均取少量血清,采用荧光实时定量 PCR(FQ-PCR) 技术进行 HBV DNA 定量检测,计算各血清标本每次冻融循环相对于第 O 次冻融循环的 HBV DNA 拷贝数的相对变化量.采用一元线性回归分析方法 分析处理实验数据.结果 15 份血清标本 HBV DNA 定量检测结果 有效范围为5.21×102-3.43×107 拷贝/ml.血清标本 HBV DNA定量检测结果显示,在第 6 次冻融循环的 15 份血清标本中,有 14 份血清标本 HBV DNA 拷贝数与基准水平比较均略有降低;经 6 次冻融循环后,累计有 18.89%(17/90)的血清标本 HBV DNA 拷贝数略高于基准水平,81.11%(73/90) 的血清标本 HBV DNA 拷贝数略低于基准水平;经 2、4、6 次冻融循环后,HBV DNA 拷贝数与基准水平比较升高＞20% 的累计血清标本数 (依次为 1、2、2 份)均分别低于降低＞20% 的累计血清标本数 (依次为 2、4、5 份).一元线性回归分析显示,每次冻融循环后 HBV DNA拷贝数与基准水平比较降低约1.4%.结论 血清冷冻时间＜24h 时,反复冻融后血清标本HBV DNA 定量检测结果可基本保持稳定.
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磷酸酯酶抑制剂冈田酸对HepG2.2.15细胞中乙型肝炎病毒复制的影响
目的 初步鉴定可能与HBV核心蛋白去磷酸化有关的磷酸酯酶.方法 以磷酸酯酶2A抑制剂冈田酸(OA)处理体外培养的人肝癌HepG2.2.15细胞.将细胞分为4组,分别加入终浓度为0(对照组)、10、20、30ng/ml的OA(OA 10 ng组、OA 20 ng组、OA 30 ng组),每组各设5孔.在培养0、2、4、6 d时分别收集各组细胞培养上清液,采用电化学发光方法检测HBsAg浓度,荧光实时定量PCR方法检测HBV DNA拷贝数.取培养2d时的各组细胞,采用蛋白质印迹方法检测HBcAg异质性,免疫荧光细胞化学染色方法检测HBcAg亚细胞定位.结果 OA 10ng组、OA 20 ng组各时间点细胞培养上清液HBsAg浓度、HBV DNA拷贝数分别与对照组相应各时间点比较,差异均无统计学意义;在培养2 d时HBcAg电泳条带、亚细胞定位分别与对照组比较均无明显异常.OA30 ng组在培养2、4、6 d时细胞培养上清液HBsAg浓度(ng/ml)均明显低于对照组相应各时间点(分别为385.9±43.1 vs 510.2±63.3、346.5±39.6 vs 484.6±59.4、295.1±32.8 vs 467.2±52.9,P值分别为0.028、0.022、0.016);在培养2 d时细胞培养上清液HBV DNA拷贝数(ml-1)明显高于对照组相应时间点(6.71±6.07 vs 6.34±5.72,P=0.022),而在培养4、6 d时均明显低于对照组相应各时间点(分另为5.80±5.19 vs 6.29±5.68、4.75±4.15 vs 6.25±5.58,P值分别为0.008和0.005);在培养2 d时HBcAg电泳条带明显增宽,约20%的HepG2.2.15细胞的细胞核内HBcAg红色荧光信号明显增强.结论 短时间、高浓度的OA处理可提高HBV DNA的复制水平和核心蛋白的磷酸化水平,提示磷酸酯酶2A可能参与了HBV核心蛋白的去磷酸化过程.
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C基因截短的HBV复制与包装
目的探讨C基因截短型HBV变异体的复制与包装.方法采用分子克隆、人工定点突变等技术构建C基因截短型HBV变异体质粒,用脂质体法转染HepG2细胞,提取细胞内及培养上清液中DNA分别进行Southern杂交,PCR及实时定量荧光PCR分析.结果经DNA测序及酶切鉴定证实C基因截短型HBV质粒载体构建成功;C基因截短型HBV为复制缺损型,与辅助质粒共转染HepG2细胞,可在细胞内及培养上清液中检测到HBV各种DNA构型;DNA定量分析提示C基因截短型HBV的包装效率较野生型HBV提高3～40倍.结论C基因截短型HBV变异体为复制缺损型,单独转染后不能在肝细胞内包装与复制,但在缺失包装信号ε的相应辅助病毒辅助下可有效复制并包装成子代病毒颗粒分泌到胞外,且包装效率大大提高.
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慢性乙型肝炎患者血清和肝组织中HBV DNA含量与庚型肝炎病毒感染的关系
目的观察慢性乙型肝炎(CH-B)患者血清、肝组织中HBV DNA含量与庚型肝炎病毒(HGV)感染的关系,探讨HGV感染对CH-B患者乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响.方法应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组织化学法、荧光定量PCR(FQ-PCR)技术方法对56份CH-B患者血清HGV RNA、肝组织HGV Ag、血清及肝组织中HBV DNA含量分别进行了检测,并将血清HGV RNA与肝组织HGV Ag的表达、HGV RNA、HGV Ag阳性与阴性患者HBV DNA含量分别进行了对比研究.结果血清HGV RNA、肝组织HGV Ag阳性分别为10份(17.9%)、8份(14.3%).血清HGV RNA阳性与肝组织HGV Ag表达显著相关(P＜0.01),但部分肝组织HGV Ag阴性患者亦有血清HGV RNA表达.血清HGV RNA、肝组织HGV Ag阳性与阴性患者血清及肝组织中HBV DNA含量差异无显著性 (P＞ 0.05). 结论 HGV感染对CH-B患者HBV复制无影响.HGV可在肝脏中复制,但致病性可能较微弱.
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MCM7与其结合蛋白的研究进展
MCM7属于微小染色体维持蛋白(minichromosome maintenance protein,MCM)家族,参与真核细胞DNA复制起始和延伸、DNA损伤、mRNA转录、细胞增殖及恶变的同时,还能与RACK1、AR、CDK等多种蛋白相互作用,共同调节细胞周期进程.MCM7作为复制执照因子(replication licensing factor,RLF),在细胞进入S期过程中起到重要作用,而其在体内的表达可作为人体恶性肿瘤和生物行为的预测因素之一.
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阿尔茨海默病患者外周血淋巴细胞G1S检验点功能障碍研究
目的 检测G1期向S期转换的特异性阻滞剂雷帕霉素在阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)患者外周血淋巴细胞G1S检验点功能,探索AD新的外周标记物及治疗靶点.方法 选择AD患者50例(AD组),另选择健康体检者50例(对照组),分离外周血淋巴细胞,经植物凝集素(促使细胞进入细胞循环)干预24 h(T24期细胞),再经雷帕霉素干预24 h(T48),流式细胞技术分别检测2组T24、T48细胞周期分布情况.结果 在T24期细胞,AD组与对照组G1期细胞和S期细胞比较,差异无统计学意义[(71.14±5.25)％ vs (71.11±4.94)％,(18.55±3.57)％ vs (18.13±3.53)％,P＞0.05];在T48期细胞,AD组G1期细胞明显低于对照组[(47.70±7.19)％ vs(71.05±4.14)％,P=0.005)],而S期细胞明显高于对照组[(29.12±4.36)％ vs (15.26±3.27)％,P=0.003)].结论 经雷帕霉素处理的AD细胞呈现不明显的G1期向S期的阻滞效应,AD患者外周血淋巴细胞G1S检验点功能障碍,G1S检验点功能障碍有望成为AD新的外周标记物及治疗靶点.
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乙型肝炎病毒反转录酶区rtI233V变异的演变及病毒学特点分析
目的 分析乙型肝炎病毒(HBV)反转录酶区rtI233V变异的演变规律及其与阿德福韦酯(ADV)耐药的相关性.方法 分析9830例慢性HBV感染者血清样本中HBV rtI233V变异的检出率.选择其中2例代表性患者,动态收集血清样本,扩增HBV RT基因并克隆测序(＞20个克隆/样本),观察rtI233V变异的演变过程.构建pTriEx-HBV(C)1.1倍野生株和3种变异株(rtI233V、rtN236T、rtI233V+rtN236T)复制子,瞬时转染HepG2肝癌细胞,分别加入不同浓度的拉米夫定(LAM)、ADV、恩替卡韦(ETV)和替诺福韦(TDF).采用实时荧光定量PCR去检测不同浓度药物作用后细胞培养上清中HBV DNA的水平,分析变异病毒复制力与表型耐药的变化特点.结果 9830例慢乙肝患者血清样本中共检出rtI233V位点变异28例,检出率0.28％,其中rtI233V单独变异19例,与rtN236T等经典耐药变异联合出现9例.该变异的检出患者均有ADV治疗史,其中16例(57.1％)接受ADV单药治疗6个月以上,12例(42.9％)接受包括ADV的多药序贯联合治疗1年以上.病毒复制力与表型耐药分析显示,rtI233V变异株的复制力与野生株接近,rtN236T变异株的复制力较野生株显著降低;rtI233V变异株对LAM、ADV、ETV和TDF均敏感,rtI233V+rtN236T联合变异对耐药性的影响不大,但rtI233V变异可明显恢复rtN236T变异株受损的复制力.结论 rtI233V位点变异与ADV应答不佳相关,虽不直接降低病毒对ADV的敏感程度,但可增加经典ADV耐药病毒株的复制力,是一种复制力补偿变异.
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HBV基因组A1846T变异对病毒复制力及核心启动子活性的上调作用研究
目的 评价乙肝病毒(HBV)基因组核苷酸(nt)A1846T变异对病毒体外复制力及核心启动子(CP)转录活性的影响.方法 385例研究对象包括116例轻中度慢性乙肝(CHB-M)患者,123例重度慢性乙肝(CHB-S)患者和146例慢加急性肝衰竭(ACLF)患者.从患者血清中提取HBV DNA,PCR扩增HBV全长基因组,统计A1846T变异的发生率.挑选代表性A1846T变异株HBV全长序列克隆至pGEM-Teasy载体中,并通过定点突变获得野生型对照.BspQⅠ/ScaⅠ双酶切HBV基因组,转染HepG2细胞,检测病毒复制力和HBsAg表达水平；用PCR分别扩增含nt1846变异型和野生型的HBVCP区片段,构建pGL3-CP双荧光素酶真核报告表达载体,转染HepG2细胞,分析检测A1846T变异对荧光素酶表达的影响.结果 HBV A1846T变异发生率随疾病程度加重依次增高,CHB-M、CHB-S和ACLF患者的变异检出率分别为31.03％、42.27％和55.48％(P＜0.01).A1846T变异株的复制力、分泌的HBsAg水平和核心启动子活性较野生株分别提高了320％、28％和85％,常见的CP区A1762T/G1764A双联变异株分别较野生株提高了67％、9％和72％,A1846T变异对提高病毒复制力的影响更强.结论 A1846T变异可显著增加HBV复制力,提高HBsAg表达水平,增强启动子活性,顺式激活下游基因转录表达,提示该变异可能与慢性乙肝重症化发生机制相关.
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慢性乙型肝炎患者血清HBV全长序列分析及复制力评价
目的 分析乙型肝炎患者HBV全长基因组序列并对其复制力进行评价.方法 从慢性乙型肝炎患者血清中提取HBV病毒DNA,PCR扩增HBV全长基因组,克隆到pGEM-Teasy载体中,每个样品挑选5～10个克隆测序,分析基因型以及全长基因组耐药相关的突变位点,并对个别位点进行定点突变.将克隆到pGEM-Teasy载体中的全长HBV基因组经BspQ Ⅰ/Sca Ⅰ双酶切后,转染入肝癌细胞系HepG2、Huh7.转染3d后榆测上清HmAg表达量及细胞内HBV复制中间体核心颗粒DNA载量,分析全长HBV基因组的复制力(1.0倍HBV复制模型).结果 从2份慢性乙型肝炎患者血清中成功获得5条HBV全长克隆,来自同一份血清的克隆核苷酸,其一致性为98%～100%,提示HBV存在准种特性.测序结果 表明5条HBV全长基因均为C型.通过定点突变又获得3个全长克隆.经序列分析发现,HBV反转录酶区存在A181V/S、L229M、V84M、M204I氨基酸位点的突变,前C/C区存在T1753C、A1762T、G1764A和G1896A核苷酸位点的突变.复制力分析提示上述位点突变后病毒复制力均有不同程度下降,L229M还可以进一步降低A181V突变株的复制力.结论 自行建立的无载体1.0倍HBV复制模型可在细胞内分泌抗原蛋白以及装配子代病毒,完成生活周期,这为下一步分析HBV的耐药表型打下了基础.此外,还可指导临床制定更加合理的抗病毒策略,筛选针对已出现或将来可能出现的耐药突变的新型抗病毒药物.
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NBS1功能研究进展
NBS1基因突变可导致一种以染色质不稳定为特征的Nijmegen断裂综合征(NBS).研究发现NBS1蛋白可与Mre11和Rad50蛋白形成一个Mre11-Rad50-NBS1复合物,在DNA的复制和DNA双链断裂的修复等过程中均起重要作用.本文对NBS1的结构及其在DNA的复制、维持染色质稳定以及DNA损伤应激反应中的作用进行综述.
关键词： Nijmegen断裂综合征 NBS1蛋白 细胞周期 DNA复制 DNA修复 -
药品不良反应信息通报
警惕加替沙星的严重不良反应加替沙星是喹诺酮类广谱抗菌药,通过抑制细菌DNA复制、转录和修复过程起到杀灭细菌的作用,用于治疗慢性支气管炎急性发作、急性鼻窦炎、社区获得性肺炎、膀胱炎、急性肾盂肾炎以及由奈瑟淋球菌引起的尿道、宫颈、直肠感染.
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药品不良反应信息通报 警惕加替沙星的严重不良反应
加替沙星是喹诺酮类广谱抗菌药,通过抑制细菌DNA复制、转录和修复过程起到杀灭细菌的作用,用于治疗慢性支气管炎急性发作、急性鼻窦炎、社区获得性肺炎、膀胱炎、急性肾盂肾炎以及由奈瑟淋球菌引起的尿道、宫颈、直肠感染.
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2016年拉斯克奖
北京时间2016年9月13日,拉斯克奖获奖者名单公布.基础医学奖颁发给William G.Kaelin,Jr.、Peter J.Ratcliffe以及Gregg L.Semenza,以表彰他们发现了人体和大多数动物细胞感知和适应氧气变化机制.临床医学研究奖颁发给Ralf F.W.Bartenschlager、Charles M.Rice以及Michael J.Sofia,以表彰他们对丙型肝炎的“复制子”系统的研究及药物的研发.特殊贡献奖颁发给Bruce M.Alberts,以表彰他在DNA复制和蛋白质生化研究方面的发现,在国家和国际科研机构中为改善人类生活而展现出的富有远见的领导力,以及在改进科学和教育方面所做出的杰出贡献.
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抗人CDC7单克隆抗体的制备与鉴定
目的 制备抗人CDC7蛋白的单克隆抗体并鉴定其生物学特性.方法 以GST-CDC7为免疫原,免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)融合,经多次筛选及克隆化,建立可以稳定分泌抗人CDC7单克隆抗体的杂交瘤细胞株.用间接ELISA,Western Blot,免疫细胞化学(ICC)对此抗体特性进行鉴定.结果 筛选到1株能稳定分泌抗人CDC7的细胞株1F7D2C9.亚类鉴定为IgG2a,轻链为kappa链,ELISA法鉴定该抗体腹水效价为1∶102 400,抗体亲和常数为1.558×109 L/mol,Western Blotting分析表明,此抗体能特异识别细胞株的天然CDC7蛋白质.免疫细胞化学进一步显示CDC7分布于细胞核中.结论 成功制备了抗人CDC7单克隆抗体,为研究CDC7与细胞癌变的关系建立了基础.
关键词： 细胞分裂周期蛋白激酶7 单克隆抗体 DNA复制 制备 鉴定 -
Geminin:一个潜在的肿瘤治疗靶点
Geminin通过与Cdt1的相互作用抑制DNA的重复复制,保证在一个细胞周期内DNA仅被复制一次.Geminin在肿瘤细胞系及肿瘤组织中高水平表达,与肿瘤临床病理学的许多指标相关,可指示的肿瘤的预后.但当降低Geminin的表达水平时,在肿瘤细胞系出现了DNA的重复复制,细胞增殖停止,而正常细胞系的DNA复制则不受影响,细胞正常增殖.因此,以Geminin为治疗靶点能够选择性的抑制肿瘤细胞生长而不影响正常细胞,其有望成为一个理想的肿瘤治疗靶点.
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MCM7与肿瘤相关因子的研究进展
微小染色体维持蛋白7（ MCM7）属于微小染色体维持蛋白家族，参与细胞周期的调控过程，与细胞生成、细胞增殖、DNA复制和延伸及肿瘤形成密切相关。因MCM7在细胞周期的 G1期和S期可被检测出，但在G0期和分化、衰老时表达水平逐渐下降甚至不能测出，因此其可作为监测细胞增殖过程的可靠生物标志物，亦可与其他肿瘤相关因子联合检测肿瘤的生成及增长。
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左氧氟沙星治疗下呼吸道感染临床分析
左氧氟沙星是新一代合成喹诺酮类抗菌药,通过抑制细菌 DNA复制所必需的酶-DNA促凝酶而阻止细菌DNA(包括质粒DNA )的复制从而产生强大的杀菌效力,并避免原粒介导的细菌耐药性的产生,以及其他抗生素产生耐药性.为了评价该药对下呼吸道感染的临床疗效和安全性,笔者进行了临床研究,结果报告如下.
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MCM蛋白在宫颈病变诊断中的应用进展
微小染色体维持蛋白(MCMp,MCM蛋白)是真核牛物DNA复制的丰要调控因子,不仅在DNA复制的起始和延伸过程中有重要作用.而且具有解螺旋酶活性,保护S期基因的稳定性.当细胞增殖时MCM蛋白表达升高,当细胞退出增殖周期时MCM蛋白分解,因此它是标志细胞增殖活性的新指标.对于宫颈癌及宫颈上皮内瘤变的诊断具有重要的临床意义,并有望成为判断宫颈肿瘤患者预后的标记物.
