非标记探针结合高分辨熔解曲线分析快速区分第1类整合子可变区启动子

目的：建立一种基于非标记探针结合高分辨率熔解曲线分析快速区分第1类整合子可变区启动子种类的方法。方法 PCR扩增质粒pACW （PcW）、pACWP2（PcW－P2）含可变区启动子区域的DNA片段，再分别以纯化的PCR产物为模板，用扩增子高分辨率熔解曲线分析对P2启动子进行区分。以质粒 pACS （ PcS ）、pACH2（ PcH2）、pACH1（ PcH1）、pACW （ PcW ）及肺炎克雷伯菌HS07－68（PcWTGN－10）、HS05－1792（PcH2TGN－10）基因组DNA为模板，结合定点突变，PCR扩增获得分别含8种不同Pc启动子序列的DNA片段，再分别以纯化的PCR产物为模板，联合运用扩增子和非标记探针高分辨率熔解曲线分析对8种不同Pc启动子进行区分。运用上述方法对2004—2007年95株非重复分离自华山医院住院患者尿液标本的第1类整合酶阳性大肠埃希菌中可变区启动子进行分析，并与测序结果进行比对。结果 P2启动子扩增子熔解曲线的熔链温度（ Tm）值明显高于无活性的P2启动子，通过扩增子高分辨率熔解曲线分析可将两者区分开，95株大肠埃希菌109个第1类整合子中，有2个整合子中检测出P2启动子，与测序结果完全一致。8种不同的Pc启动子通过扩增子高分辨率熔解曲线分析分为3组：PcS、PcSTGN－10；PcW、PcWTGN－10；PcH1、PcH1TGN－10、PcH2、PcH2TGN－10。非标记探针高分辨率熔解曲线分析将8种不同的 Pc 启动子分为4组 PcS， PcH1；PcH2， PcW；PcSTGN－10， PcH1TGN－10；PcH2TGN－10，PcWTGN－10。联合运用扩增子和非标记探针高分辨率熔解曲线分析可将8种不同的Pc启动子相互区分开，95株大肠埃希菌109个第1类整合子中，共检测出5种不同的Pc启动子PcS，PcW，PcH1，PcH2TGN－10，PcWTGN－10，与测序结果完全一致。结论本研究成功建立了一种基于非标记探针结合高分辨率熔解曲线分析的方法，用于快速区分第1类整合子可变区启动子，该方法结果准确、费用低，可用于临床对第1类整合子可变区启动子多态性的研究。（中华检验医学杂志，2017，40：95－100）

纤维蛋白原基因β启动子区多态性与特发型下肢深静脉血栓的相关性研究

目的 探寻纤维蛋白原基因β(fibrinogen gene β,FGB)启动子区可能存在的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP),并揭示其对特发型下肢深静脉血栓(idiopathic deep venous thrombosis,IDVT)的影响. 方法 前瞻性研究IDVT组及健康对照组各120例.对受试者纤维蛋白原Bβ启动子区完整测序及限制性长度多态性法(restriction fragment length polymorphsm,RFLP)双重检测,探寻可能存在的SNP并行Hardy-Weinberg遗传平衡度检验、连锁不平衡分析;后,比较2组基因型频率并进行多因素Logistic回归分析.结果 FGB启动子区存在6种SNP,即-148C/T,-249C/T,-455G/A,-854G/A,-993C/T和-1420G/A;-993 C/T与-455G/A(r2=0.699)、-993C/T与-148C/T(r2 =0.509)、-455G/A与-148C/T(r2=0.556)之间存在较强的连锁不平衡关系;2组-148C/T、-249C/T、-455G/A和-1420G/A的基因型频率差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 纤维蛋白原每增加1个U,IDVT的发病风险相应增加4.579倍;-148T、-455G、-1420A等位基因是IDVT的危险因素;-993C/T可能通过与-455G/A、-148C/T的连锁不平衡方式对IDVT易感性产生间接影响.

中国南方汉族人家族性激素耐药型肾病综合征家系NPHS2基因突变

目的 分析中国南方汉族人家族性激素耐药型肾病综合征(SRNS)家系NPHS2基因突变及其特点.方法 研究对象为A、B、C 3个南方汉族人SRNS家系先证者及其姐和父母,50例尿检正常的南方汉族成年人作为对照人群.取所有研究对象外周静脉血3 ml,提取基因组DNA,PCR扩增NPHS2全部8个外显子及其周围的部分内含子和启动子全长序列,对PCR产物直接进行DNA序列测定.结果 对3个南方汉族人SRNS家系先证者NPHS2全部8个外显子及其周围的部分内含子进行突变分析,未发现NPHS2突变,仅在外显子8上检测到1个NPHS2基因多态性(954T＞C).在3个家系的先证者及其姐和父母的NPHS2启动子上检测到6个变异:-1715A＞G、-1709G＞A、-1000A＞T、-670C＞T、-116C＞T和-51G＞T.其中5个变异(-1709G＞A、-1000A＞T、-670C＞T、-116C＞T和-51G＞T)在100条正常染色体中也有检出,它们在SRNS患者中的等位基因频率分别与在对照人群中的等位基因频率比较差异均无统计学意义(P＞0.05);另1个变异(-1715A＞G)在家系C的先证者及其母亲(尿检正常)中检出,为杂合变异,而在100条正常染色体中未发现.-1000A＞T为新发现的NPHS2基因多态性,-1715A＞G为新发现的NPHS2变异.结论 NPHS2基因突变不是本研究3个南方汉族人家族性SRNS家系的主要致病原因.

急性髓性白血病p15INK4B基因表达和基因甲基化状态的研究

p15INK4B(p15)基因被认为是一个重要的肿瘤抑制基因,对细胞周期起负调控作用[1].p15基因的启动区中有一CpG岛,许多血液系统恶性病变表现为CpG岛异常的高甲基化状态[2].虽然有关急性白血病p15基因启动区中CpG岛甲基化异常已有不少的研究报道,但主要见于成人,CpG岛异常甲基化与该基因表达水平的关系研究则较少见.本研究同时检测儿童急性髓性白血病(acute myeloid leukemia, AML)p15基因表达水平和甲基化状态,以探讨两者之间的相互关系以及在急性白血病发病中的作用.

托瑞米芬逆转乳腺癌耐药蛋白介导的多药耐药机制

目的 探讨托瑞米芬逆转乳腺癌耐药蛋白(BCRP)介导的多药耐药机制。方法 通过基因扩增，构建分别由BCRP启动子和巨细胞病毒(CMV)启动子启动表达BCRP的重组质粒pcDNA3-Promoter-BCRP和作为对照的质粒pcDNA3-CMV-BCRP，将其分别转染雌激素受体α（ERα）阳性的MCF-7和ERα阴性的MDA-MB-231乳腺癌细胞系，建立由BCRP启动子和CMV启动子启动表达BCRP的4种耐药细胞系MCF-7/Promoter-BCRP、MCF-7/CMV-BCRP、MDA-MB-231/PromoterBCRP和MDA-MB-231/CMV-BCRP。在耐药细胞培养基中加入托瑞米芬，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot、外排实验以及细胞毒性实验观察托瑞米芬对不同细胞系的耐药逆转效果。结果与空白对照组（未加药物）相比，托瑞米芬以剂量依赖方式抑制BCRP mRNA的表达，0.1、1和10 μmol/L托瑞米芬处理组MCF-7/Promoter-BCRP细胞中BCRP mRNA的表达水平分别下调29.5％(P＜0.05)、68.1％ (P＜0.01)和97.4％(P＜0.01)；MCF-7/Promoter-BCRP细胞经托瑞米芬和17β-雌二醇联合处理后，细胞中BCRP mRNA的相对表达水平为64.2％±1.3％，明显高于托瑞米芬单独处理组(3.8％±0.2％，P＜0.01)。托瑞米芬对各组细胞系中BCRP蛋白表达的调控作用与mRNA相似。经托瑞米芬处理后，MCF-7/Promoter-BCRP细胞内米托蒽醌的荧光强度显著增强，外排米托蒽醌的能力降低了 47.3％ (P ＜0.05)；经托瑞米芬和17β-雌二醇联合处理后，MCF-7/Promoter-BCRP细胞内米托蒽醌的荧光强度明显低于托瑞米芬单独处理组，外排米托蒽醌的能力升高了61.5％。托瑞米芬可有效逆转MCF-7/Promoter-BCRP细胞对米托蒽醌的耐药性。上述作用在MCF-7/CMV-BCRP、MDA-MB-231/Promoter-BCRP和MDA-MB-231/CMV-BCRP细胞中未能体现。结论 托瑞米芬可能通过ERot的介导与BCRP启动子上游调控序列中的ERE结合，负性调节BCRP的表达，抑制BCRP蛋白的功能，在体外有效逆转BCRP介导的多药耐药。

乙型肝炎病毒核心启动子区核苷酸G1613A和C1653T变异的临床意义

目的 评价HBV G1613A和C1653T变异对乙型肝炎患者疾病进展、病毒体外复制力及核心启动子(CP)转录活性的影响.方法 共纳入258例研究对象,包括65例急性乙型肝炎(AHB)患者,120例慢性乙型肝炎(CHB)患者和73例慢加急性肝衰竭(ACLF)患者.从患者血清中提取HBV DNA,PCR扩增HBV DNA全长基因组,统计G1613A、C1653T和G1613A+C1653T变异的发生率.构建相应载体进行体外功能实验,观察病毒质粒转染HepG2细胞后对病毒复制力及其CP转录活性的影响.结果 258例患者中共检出B、C、D三种基因型,其检出率分别是22.2％、76.2％和1.6％.G1613A、C1653T及G1613A+C1653T变异发生率随疾病程度加重依次升高.AHB、CHB和ACLF患者上述3种变异的检出率分别为13.70％、31.80％和45.20％(P＜0.01),2.30％、16.30％和27.40％(P＜0.01),2.29％、12.07％和23.29％(P＜0.05).与野生株相比,G1613A变异株复制力升高6％,HBsAg降低15％,HBeAg表达呈阴性,CP转录活性降低16.2％;C1653T变异株复制力升高10％,HBsAg升高55％,HBeAg与野生株接近,CP转录活性升高17.1％;G1613A+C1653T变异株复制力升高7％,HBsAg升高66％,HBeAg升高227％,但对CP转录活性没有影响.结论 G1613A、C1653T在CP区的变异可增加HBV复制力,影响CP转录活性和HBV抗原的表达,G1613A+C1653T联合变异可能对这些功能产生协同作用,推测这三种变异与乙肝重症化发生机制相关.

乙型肝炎病毒DNA多聚酶RNase H对细胞凋亡易感基因表达的上调作用

目的 探讨乙型肝炎病毒DNA多聚酶(HBV DNA P)结构域蛋白RNase H对细胞凋亡易感基因(CAS)的转录激活作用.方法 以HBV DNA P 结构域蛋白RNase H的反式调节因子的基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定CAS的启动子区域(CASp),扩增CASp并克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-CASp报告载体.分别以该质粒单独或与pcDNA3.1(-)-RH共转染肝癌细胞系HepG2细胞,ELISA法检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性,并以pCAT3-Basic空载体、pCAT3-TXNRD1p分别转染HepG2细胞作为阴性和阳性对照.结果 pCAT3-CASp和pcDNA3.1(-)-RH瞬时共转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-CASp的1.5倍,是pCAT3-Basic空载体的2.7倍.结论 本实验进一步验证了我室利用基因表达谱技术研究RNase H蛋白反式激活作用的结果.我室克隆的CAS启动子具有顺式激活下游基因的活性;HBV的RNase H蛋白具有对CAS的反式激活作用.

HBV基因组A1846T变异对病毒复制力及核心启动子活性的上调作用研究

目的 评价乙肝病毒(HBV)基因组核苷酸(nt)A1846T变异对病毒体外复制力及核心启动子(CP)转录活性的影响.方法 385例研究对象包括116例轻中度慢性乙肝(CHB-M)患者,123例重度慢性乙肝(CHB-S)患者和146例慢加急性肝衰竭(ACLF)患者.从患者血清中提取HBV DNA,PCR扩增HBV全长基因组,统计A1846T变异的发生率.挑选代表性A1846T变异株HBV全长序列克隆至pGEM-Teasy载体中,并通过定点突变获得野生型对照.BspQⅠ/ScaⅠ双酶切HBV基因组,转染HepG2细胞,检测病毒复制力和HBsAg表达水平；用PCR分别扩增含nt1846变异型和野生型的HBVCP区片段,构建pGL3-CP双荧光素酶真核报告表达载体,转染HepG2细胞,分析检测A1846T变异对荧光素酶表达的影响.结果 HBV A1846T变异发生率随疾病程度加重依次增高,CHB-M、CHB-S和ACLF患者的变异检出率分别为31.03％、42.27％和55.48％(P＜0.01).A1846T变异株的复制力、分泌的HBsAg水平和核心启动子活性较野生株分别提高了320％、28％和85％,常见的CP区A1762T/G1764A双联变异株分别较野生株提高了67％、9％和72％,A1846T变异对提高病毒复制力的影响更强.结论 A1846T变异可显著增加HBV复制力,提高HBsAg表达水平,增强启动子活性,顺式激活下游基因转录表达,提示该变异可能与慢性乙肝重症化发生机制相关.

三乙烯四胺对c-myc启动区转录活性的调节作用

目的 探讨三乙烯四胺 (TETA) 如何调节c-myc基因表达.方法 利用圆二色谱分析TETA对c-myc启动区核酸酶超敏元件Ⅲ1(c-myc NHE Ⅲ1)碱基序列形成的G-四链体DNA(G4-DNA)结构稳定性的影响.同时,分别构建含c-myc NHE Ⅲ1的野生型和突变型的c-myc启动区荧光报告质粒,并分别转染HEK293细胞24 h后,再接种到96孔板,TETA以终浓度0, 0.1,1.0,10及100 μmol·L-1处理8 h,测定荧光素酶活性,计算TETA对其转录活性抑制率.结果 圆二色谱实验结果表明,TETA 5 μmol·L-1就能够进一步增强c-myc NHE Ⅲ1在240 nm处的负峰和260 nm处的正峰的形成,即增强G4-DNA结构的稳定性.报告基因分析结果表明,TETA能够浓度依赖性地抑制野生型c-myc启动区荧光素酶基因的表达,但对突变型c-myc启动区荧光素酶基因的抑制能力明显下降.在TETA 1 nmol·L-1作用时,对突变型c-myc启动区荧光素酶基因抑制率仅为4.3%, 而对野生型的抑制率还高达30.4%.结论 TETA可能通过稳定c-myc NHE Ⅲ1序列形成的G4-DNA结构调节基因的表达.

脑胶质瘤MGMT启动区甲基化PCR检测方法的对比分析

血清瘦素与脑梗死临床相关性研究

目的：探讨脑梗死患者血浆瘦素水平与性别、年龄、时间及其与基因型的关系。方法对52例缺血性脑梗死患者和20例健康体检者分别采用酶联免疫分析法测定血浆瘦素水平，同时检测瘦素基因启动子区-2548G/a 的基因型和等位基因频率。结果脑梗死组的血清瘦素浓度明显高于对照组，差异有显著意义；脑梗死患者血清瘦素水平近于正态分布；血浆瘦素水平与脑梗死患者的年龄经相关分析：女 r =0.014；男 r =0.106。血浆瘦素水平与脑梗死时间经相关分析：r =0.098。缺血性脑梗死瘦素基因型aa和Ga在脑梗死男女患者血清瘦素水平进行分析，结果t值分别为0.261和1.891。两者均 P >0.05。结论脑梗死组的血清瘦素浓度明显高于对照组，差异有显著意义，；并近于正态分布；男性脑梗死患者血清瘦素水平变化幅度比较窄；而女性变化幅度宽；与脑梗死患者的年龄及卒中时间无相关性；瘦素基因启动子区-2548G/a 位核苷酸多态性。

江西将全面启动区域医疗中心建设

今年江西省将在分析现状基础上，找出制约居民疑难病诊治的影响因素，制定实施《江西省医疗中心管理办法》，全面启动区域医疗中心建设工作，并探索建立适合省情的区域性医疗中心评估体系。

瘦素基因启动子区-2548G/A功能多态性与抗精神病药源性肥胖的相关分析

目的探讨瘦素基因启动子区-2548G/A功能多态性是否与首次治疗精神分裂症患者的抗精神病药物(APS)急性期治疗导致的体重增加相关.方法采用聚合酶链反应-限制片段长度多态性(PCR-RFLP)技术分析128例患者(男61例,女67例)-2548G/A等位基因和基因型分布频率,APS(利培酮或氯丙嗪)单药治疗10周,治疗前后每周测体重和体重指数(BMI),采用MRI测治疗前后腹部脂肪分布(30例),分析等位基因和基因型与基础体重指标和其变化值的相关性;同时分析38名性别、年龄和BMI相匹配的健康对照者,其中22例进行MRI扫描. 结果治疗后患者体重增加是基础体重的(6.2±5.7)%,腹部脂肪增加是基础腹部皮下脂肪(SUB)的(38.5±42)%、腹内脂肪的(40.0±41.2)%;-2548G/A等位基因和基因型在患者组和对照组分布频率差异无显著意义;在体重增加≤7%和>7%患者组等位基因和基因型分布频率差异有非常显著意义(χ2=7.529,df=1,P=0.006;OR=1.941;95%CI: 1.175～3.207);基因型对患者组或对照组的基础体重指标无显著影响;与携带G等位基因患者相比,AA基因型携带者治疗后BMI(P=0.003)和SUB(P=0.009)明显增加.结论瘦素基因启动子区-2548G/A功能多态性与APS急性期治疗致汉族精神分裂症患者体重增加尤其腹部肥胖显著相关,-2548A是APS药源性体重增加的基因危险因子.

含不同启动子的腺病毒载体介导的人β2肾上腺素能受体基因在心肌细胞的表达

目的观察不同的启动子cmv、mlc-2v对腺病毒载体介导的人β2肾上腺素能受体(β2-AR)基因在大鼠心肌细胞中表达.方法分别构建含cmv、mlc-2v启动子并携带人β2-AR基因的重组腺病毒Adcmv β2 AR、Admlc β2 AR,用以感染心肌细胞,并检测心肌细胞对人β2-AR基因的表达及cAMP的含量.结果经RT-PCR、Western免疫印迹分析证实感染的心肌细胞均表达人β2-AR;放射性配基检测显示含mlc-2v 启动子Admlc β2 AR感染的心肌细胞β2-AR密度低于含cmv启动子的Adcmv β2 AR感染组(P<0.01);经10 μmol/L异丙肾上腺素作用,感染组的心肌细胞内cAMP含量明显高于对照组,感染组间存在明显差异(P<0.01).结论含不同启动子的腺病毒载体感染心肌细胞后均可表达具有生物活性的人β2-AR,但两者存在差异.

反复自然流产患者纤溶酶原激活剂抑制物-1基因启动区4G/5G多态性分析

纤溶酶原激活剂抑制物-1(PAI-1)水平升高与血栓性疾病密切相关,且存两者间在基因多态性依赖关系[1,2].PAI-1基因启动子区4G/5G多态性与早产、流产、死胎等妊娠并发症有关[3].本研究旨在探讨PAI-1基因4G/5G多态性与反复自然流产的关系,为早期诊断和治疗不明原因反复自然流产提供分子生物学依据.

乳腺癌组织中NF-κBP50的表达及临床意义

细胞核因子NF-κBP50是一类蛋白质,具有和某些基因上启动区的固定核苷酸序列结合而启动基因转录的功能[1].国外文献报道甲状腺、非小细胞性肺癌和大肠癌中NF-κB呈活化表达.目前国内尚少见到乳腺癌方面的研究报道.我们采用免疫组织化学和蛋白质印迹法检测了乳腺癌组织中NF-κBP50的表达,探讨NF-κBP50表达与临床意义,现将果报道如下.

非酒精性脂肪肝过氧化物酶体增殖物激活受体α基因甲基化水平与高脂血症的相关性研究

目的：检测非酒精性脂肪肝（NAFLD）患者外周血过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARα）基因启动子的甲基化水平与高脂血症的相关性。方法病例对照研究。收集对照组(N)60例、高脂血症组（NT）62例和NAFLD合并高脂血症组（TT）65例的临床资料，测定血清中总胆固醇（TCH）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的含量。使用以甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）法，检测外周血 PPARα基因启动子甲基化水平。并分析其与血脂水平等临床资料的关系。结果实验三组性别和年龄相匹配。 NT组和TT组TCH和TG均显著高于N组，TT组TG较NT组明显上升，而两组TCH含量无明显差异；TT组PPARα基因启动子甲基化率明显高于N组及NT组（X2=5.05、4.13，P均<0.05），后两组无明显差异（P＞0.05）；该基因的甲基化率与TG有相关性（t =2.38，P<0.05），而与患者年龄、身高、体质量、体重指数、TCH、HDL-C和LDL-C无相关性（t =1.04、1.12、1.56、0.08、1.93、0.98、0.72，均P＞0.05）。结论 NAFLD患者PPARα基因启动子的甲基化率明显增加，与高甘油三酯血症呈正相关，是NAFLD的重要发病机制之一。

DNA甲基化对白血病ABO基因表达的影响

目的 探讨白血病ABO基因启动子区CpG岛甲基化对ABO基因表达的影响.方法 以25例白血病患者及20名健康对照者为研究对象,同时以不同浓度去甲基化药物地西他滨处理白血病细胞株K562、HL-60和Jurkat细胞,采用序列特异性引物PCR(PCR-SSP)法检测ABO基因分型,采用实时荧光定量PCR法检测ABO mRNA表达,采用亚硫酸氢盐测序法检测ABO基因启动子区CpG岛甲基化情况.结果 ①急性淋巴细胞白血病组(10例)和急性髓系白血病组(10例)ABO基因启动子平均甲基化率分别为53.85％和18.22％,明显高于健康对照组(20名,2.33％)和慢性髓性白血病组(5例,2.12％).②K562细胞的ABO基因型为O1O1,药物作用前后ABO基因型变化不大;HL-60和Jurkat细胞药物作用前基因型无法辨认,药物作用后ABO基因型为O1A1和A1O2.③K562细胞ABOmRNA相对表达水平为1 275.67±35.86,明显高于HL-60和Jurkat细胞(0.54+0.07和0.82±0.16)(P值均＜0.05).④K562、HL-60、Jurkat细胞ABO基因启动子区甲基化率分别为0、58.14％和96.74％;与药物作用前比较,随地西他滨浓度增高,HL-60和Jurkat细胞的甲基化水平下降、ABO mRNA表达水平增高,差异均有统计学意义(P值均＜0.05).结论 ABO基因启动子区甲基化水平与急性白血病ABO基因表达呈负相关,DNA甲基化导致ABO基因沉默是急性白血病ABO抗原表达减弱的重要机制之一.

脑梗死患者纤维蛋白原Bβ基因启动区单核苷酸多态性研究

为探讨纤维蛋白原(Fg) Bβ启动区单核苷酸多肽性(SNP)变化与脑梗死的关系,我们在广东汉族人群中选择了Fg Bβ启动区三个SNP位点-148C/T、-455G/A、-854G/A,观察了这些基因位点之间相互关系及与脑梗死发生的相关性.

肿瘤坏死因子基因启动子-308位多态性与强直性脊柱炎相关性研究

目的探讨肿瘤坏死因子(TNF)启动子多态性与强直性脊柱炎(AS)的相关性.方法采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP),对78例AS患者和52名HLA-B27阳性健康人群进行TNF启动子多态性分析.同时采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测了患者和正常人群血清TNF-α水平.结果 78例AS患者中为-308.1.1基因型的有61例(78.2%),明显高于HLA-B27阳性的健康人(55.8%)(P＜0.05),而AS患者的-308.1.2和-308.2.2基因型频率相应降低,且后两种基因型患者血清TNF-α水平及临床部分指标明显高于-308.1.1基因型的患者.结论研究显示-308.1的等位基因在AS患者中比HLA-B27阳性的正常对照人群更多见.TNF基因该区域多态性与AS存在相关性.