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用PCR-HRM方法快速区分白纹伊蚊和埃及伊蚊
目的 建立快速区分白纹伊蚊和埃及伊蚊的PCR结合高分辨率熔解曲线(PCR-HRM)方法.方法 设计针对白纹伊蚊和埃及伊蚊线粒体ATP6和Cytb基因的2对通用引物,用PCR-HRM方法区分白纹伊蚊和埃及伊蚊.结果 白纹伊蚊和埃及伊蚊ATP6和Cytb基因均扩增出不同形状的曲线,蚊种区分结果与形态学鉴定结果一致.结论 采用基于ATP6和Cytb基因的PCR-HRM能准确快速区分白纹伊蚊和埃及伊蚊,可作为白纹伊蚊和埃及伊蚊不完整样本的鉴定方法.
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HRM技术在掌跖角化病KRT9基因致病突变检测中的应用
目的:建立一种低成本、高通量、简便易行、准确可靠的检测掌跖角化病致病突变的方法.方法:应用高分辨率熔解曲线(HRM)方法检测掌跖角化病患者KRT9基因第一外显子突变情况,并与测序结果进行比较.结果:HRM方法能准确区分野生型和杂合型致病突变536T＞C、548A＞G,测序结果与HRM结果完全一致.结论:HRM方法能简单快速、准确经济地检测KRT9基因突变,能用于掌跖角化病患者的大样本临床初筛.
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高分辨率熔解曲线分析检测家蝇kdr基因突变
目的 探讨kdr基因在家蝇溴氰菊酯抗性增加中的作用.方法 首次将高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)分析与半定量PCR相结合,用于分析家蝇抗性基因kdr扩增和突变情况.对扩增的PCR产物进行测序来验证HRM准确性.结果 与敏感品系家蝇相比,kdr的mRNA表达量在现场品系家蝇中没有显著改变(P＞0.05).使用HRM对kdr进行突变分析,发现所有样本均为同一基因型.经核酸测序,该扩增片段没有突变位点.结论 杭州家蝇溴氰菊酯抗性增加与kdr基因无关.
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基于HRM的常见伞形科香辛料快速鉴定
目的:4种香辛料小茴香、孜然、葛缕子、莳萝子与其混伪品蛇床子、防风子因外形特征相似,易混淆使用,带来安全隐患.针对鉴别困难的问题,建立高分辨率熔解曲线(HRM)分析法,以实现简便、快速鉴别的目的.方法:收集这4种香辛料及常见混伪品蛇床子、防风子共23份样本,作为参照样本,提取总DNA,基于内转录间隔区2(ITS2)序列通过聚合酶链式反应(PCR)进一步确定物种,并应用HRM技术建立检测方法和熔解曲线模型.香辛料市场收集这4种香辛料共17份样本,作为市场样本,通过HRM技术鉴定物种是否与标签相符.结果:小茴香、孜然、葛缕子、莳萝子、蛇床子、防风子的熔解曲线均表现出良好差异性,能明显区分开;17份市场样本中,编号N1和N3样品熔解曲线与标签显示的莳萝子熔解曲线具有明显差异,进一步测序结果显示二者均为毒芹子.结论:HRM技术能实现小茴香等伞形科香辛料及其混伪品间的可视化鉴别,可作为DNA条形码技术的有力补充,在中药资源鉴定中应用前景广阔.
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基于DNA熔解曲线技术的金银花种质鉴定
将高分辨率熔解曲线(high resolution melting curve analysis,HRM)技术应用于金银花种质鉴定中,对已知7对SSR(简单重复序列,simple sequence repeats)引物进行筛选,通过熔解曲线峰型及Tm差异,确定适合鉴别引物并考察其DNA模板浓度、退火温度及循环数的适宜范围.结合SIMCA-P软件对荧光信号进行处理分析,结果表明利用其中4对引物的熔解曲线可以区分金银花的3个主栽种质,为进一步完善金银花种质鉴定方法提供了依据.
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基于熔解曲线分析技术的木通类药材的分子鉴别
高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)是一种主要用于基因分型和突变扫描的分子诊断技术,在中药真伪鉴定中有着广泛应用前景.该文将高分辨率熔解曲线技术应用于木通药材的鉴别,即选择trnH-psbA通用引物,在退火温度为58℃,35个循环数的条件下,建立正品木通药材的熔解曲线模型,并筛选确定其DNA模板浓度、引物浓度、Mg离子浓度的适宜范围.结果表明,在DNA质量浓度为5～125 mg·L-1、引物浓度0.4 μmol·L-1、Mg离子浓度2.0 mmol·L-1的条件下,木通药材的熔解曲线为双峰,其Tm为(81.84±0.16),(85.28 ±0.16)℃;川木通熔解曲线为单峰,其Tm为(83.22 ±0.19)℃;关木通熔解曲线为双峰,其Tm为(81.67±0.14),(84.24 ±0.10)℃.该方法可以实现简单、快速、高通量、可视化的的木通类药材的鉴定.
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配对盒4基因Arg121Trg多态性与2型糖尿病的相关性
目的 探讨配对盒4(Pax4)基因Arg121Trg多态性(rs114202595)与云南省昆明地区2型糖尿病的相关性.方法 根据口服75 g葡萄糖耐量试验(OGzTT)将1 076例云南省昆明地区人群分为2型糖尿病组(T2DM)、糖耐量减低组(IGT)和健康对照组(NGT),应用高分辨率熔解曲线分析方法(HRM)检测Pax4基因Arg121Trg基因型,观察3组人群中基因型和等位基因的分布情况,同时分析T2DM人群中不同基因型相关临床变量的差异性.结果 1)Pax4基因Arg121 Trg GG基因型(Arg/Arg)及A等位基因(Trg121)在T2DM组中的频率分别为0.909和0.047,在IGT组中为0.935和0.035,在NGT组中为0.939和0.03.2)T2DM组Arg121Trg 多态性GA+ AA基因型(Arg/Trg+ Trg/Trg)人群胰岛素使用率显著高于GG基因型(Arg/Arg)人群(P=0.001),而其他临床变量在T2DM组中两种基因型人群间比较均无明显差异.结论 Pax4基因Arg121Trg多态性A等位基因可能是云南省昆明地区2型糖尿患者群胰岛β功能进展性紊乱的一个分子标记.
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高分辨率熔解曲线分析幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药gyrA基因突变的研究
目的 优化和建立PCR-高分辨率熔解曲线(HRM)的方法,分析幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药基因gyrA基因突变,为临床选择个体化的幽门螺杆菌根除方案提供帮助.方法 收集2013年5月至2013年10月南通大学附属东台医院消化内科进行胃内窥镜检查的45例消化性溃疡患者的胃黏膜组织,微需氧条件(5%O2、10%CO2、85%N2)下培养出23株幽门螺杆菌临床分离菌株,采用E-test法进行左氧氟沙星药敏试验.提取患者胃黏膜组织和临床分离菌株DNA,PCR扩增gyrA基因部分片段后进行序列分析,采用PCR-HRM分析gyrA基因突变.结果 左氧氟沙星的耐药率为47.8%(11/23).11株耐药菌株中10株菌株gyrA基因发生突变,突变形式主要为C261A、G271T、A272G+G514A.9.1%(1/11)耐药菌株和所有敏感菌株gyrA基因均未发生突变.PCR-HRM方法的特异度和重复性均为100%,低检测限为102 copies/μl.结论 PCR-HRM方法能准确、快速检测幽门螺杆菌gyrA基因突变.
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高分辨率熔解曲线分析技术检测苯丙酮尿症患者的苯丙氨酸羟化酶基因突变
目的 应用高分辨率熔解曲线(HRM)分析技术检测苯丙酮尿症患者苯丙氨酸羟化酶基因突变.方法 利用PCR扩增13例苯丙酮尿症(PKU)患者的苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因第6、7、11及12外显子,然后对PCR产物进行HRM分析,通过DNA测序对HRM结果进行验证.结果 在13例PKU患者的26个PAH等位基因中共检测出5种不同突变基因,总检出率为38.5％.常见的突变类型是R243Q和A434D.检测出两种多态性位点为Q232Q和V245V.HRM分析结果与测序结果完全一致.结论 HRM技术具有简单、快速、易操作、准确等优点,可用于PKU患者PAH基因突变筛查.
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高分辨率熔解曲线分析检测家蝇cyp6d1基因突变
目的 探讨家蝇溴氰菊酯抗性机制.方法 使用高分辨率熔解曲线(high-resolution melting,HRM)分析与半分析定量PCR相结合的方法,分析家蝇抗性基因cyp6d1突变和扩增情况.通过对扩增的PCR产物进行测序来验证HRM准确性.结果 与敏感品系相比,抗性品系cyp6d1基因的mRNA表达量显著增加(P=0.0002),抗性品系cyp6d1基因的mRNA表达量是敏感品系的50.7倍;使用HRM对cyp6d1进行突变分析,将其分为3种基因型,分别为A型(Tm=85.5℃)、B型(Tm=87.3℃)和C型(Tm=88.5℃);经测序,该HRM分析结果分别与3类基因序列型相对应.A型基因型为纯合的1087G、1101T和1155A(对应GenBank序列号U22367.1);C型基因型为纯合的1087A、1101G和1155G;B型基因型为A型和C型的杂合型.生物信息学分析表明,该突变为无意义突变.结论杭州市家蝇抗性品系cyp6d1基因mRNA表达量显著增加,可能是家蝇抗性增加的原因之一.
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高分辨熔解曲线法检测骨髓增殖性肿瘤患者JAK2V617F基因突变
本研究探讨高分辨率熔解曲线(High resolution melting,HRM)法检测骨髓增殖性肿瘤(MPN)患者JAK2V617F基因突变的可行性.随机抽取29份2008年1月至2011年1月确诊为MPN患者的骨髓标本,应用HRM法检测JAK2V617F基因突变情况,并与等位基因特异性聚合酶链反应(AS-PCR)和测序法的检测结果比较分析.结果表明,经HRM法检测,在29份MPN患者骨髓标本中检出JAK2 V617F突变阳性11例,突变率为37.9％;与基因测序法比较,结果完全一致,符合率100％.而AS-PCR法与测序法比较,Kappa=0.179,P=0.316,一致性强度较差.结论:HRM方法具有简便、快速、特异性高等优点,可作为临床JAK2V617F基因突变的优选方法.
关键词： 高分辨率熔解曲线 JAK2V617F突变 骨髓增殖性肿瘤 -
高分辨率熔解曲线小扩增子法结合混样法在线粒体13928G>C突变分析中的应用
目的 探讨高分辨率熔解曲线(high rgsolution meltjng,HRM)技术在线粒体13928G>C突变分析中应用的可行性.方法 在PCR前,体系中加入饱和染料、高温寡核苷酸内参(96℃)、低温寡核苷酸内参(60℃)和与待测样本等体积的已知基因型为GG的模板进行混样扩增,运用HRM技术对定量DNA的PCR产物进行基因分型,并从中随机抽取20例进行测序验证.结果 930例样本中野生型GG占728例,突变型CC占202例;DNA定量有助于HRM分析时对分型结果的判断;同时联合运用高、低温内参比只用一种内参分型效果好;随机抽取的20例样本的测序结果与HRM分型结果相一致.结论 运用高分辨率熔解曲线小扩增子法结合混样法可对线粒体基因组13928G>C突变进行准确分型.
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应用高分辨熔解曲线法快速鉴定功能性第2类整合子
目的：应用高分辨率熔解曲线法快速鉴定功能性第2类整合子。方法收集99株2011年8月—2012年8月非重复分离自临床标本的第2类整合酶阳性变形杆菌，以基因组DNA为模板，PCR扩增包含第2类整合酶基因突变位点一段60 bp的片段，高分辨率熔解曲线分析后测序验证。结果功能性第2类整合子与普通第2类整合子高分辨熔解曲线具有显著差别，测序结果与高分辨率熔解曲线法鉴定结果一致。结论应用高分辨率熔解曲线法可快速准确进行功能性第2类整合子的筛查鉴定。
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高分辨率熔解曲线分析技术在检测非小细胞肺癌组织和血清EGFR基因突变中的应用
目的 探索高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)分析技术在检测肺癌组织及血清表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突变中的应用.方法 收集85例非小细胞肺癌石蜡包埋组织(FFPE)标本及对应的39例血清标本,分别提取DNA,自行设计引物,优化扩增体系,利用HRM技术进行EGFR基因18 -21外显子突变检测,对检测出突变阳性的标本扩增片段进行基因测序.统计39例FFPE标本与血清标本突变结果的符合率并分析EGFR基因突变与临床特征的关系.结果 85例FFPE标本中,HRM法检测出EGFR基因突变共48例,总突变率为56.47％,基因测序检测出EGFR基因突变共44例,其中18、19外显子突变类型各一种,基因型分别是G719S和2236 - 2250Del；20、21外显子突变类型各两种,20外显子突变基因型为插入突变insGGT和无义突变Q787Q,21外显子突变基因型为L861Q和L858R.39例血清与FFPE配对标本,EGFR基因突变阳性标本检出的符合率为92.31％ (12/13),阴性标本为100％ (26/26).EGFR突变常发生于女性患者、非吸烟患者、肺腺癌患者(均为P＜0.05),临床分期Ⅰ-Ⅱ与Ⅲ-Ⅳ的患者EGFR基因突变无显著性差异(P=0.159).结论 本研究表明HRM技术能准确检测NSCLC患者组织或血清EGFR基因突变,快速、经济,可有效减少污染,适宜临床推广应用.
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非标记探针结合高分辨熔解曲线分析快速区分第1类整合子可变区启动子
目的：建立一种基于非标记探针结合高分辨率熔解曲线分析快速区分第1类整合子可变区启动子种类的方法。方法 PCR扩增质粒pACW （PcW）、pACWP2（PcW－P2）含可变区启动子区域的DNA片段，再分别以纯化的PCR产物为模板，用扩增子高分辨率熔解曲线分析对P2启动子进行区分。以质粒 pACS （ PcS ）、pACH2（ PcH2）、pACH1（ PcH1）、pACW （ PcW ）及肺炎克雷伯菌HS07－68（PcWTGN－10）、HS05－1792（PcH2TGN－10）基因组DNA为模板，结合定点突变，PCR扩增获得分别含8种不同Pc启动子序列的DNA片段，再分别以纯化的PCR产物为模板，联合运用扩增子和非标记探针高分辨率熔解曲线分析对8种不同Pc启动子进行区分。运用上述方法对2004—2007年95株非重复分离自华山医院住院患者尿液标本的第1类整合酶阳性大肠埃希菌中可变区启动子进行分析，并与测序结果进行比对。结果 P2启动子扩增子熔解曲线的熔链温度（ Tm）值明显高于无活性的P2启动子，通过扩增子高分辨率熔解曲线分析可将两者区分开，95株大肠埃希菌109个第1类整合子中，有2个整合子中检测出P2启动子，与测序结果完全一致。8种不同的Pc启动子通过扩增子高分辨率熔解曲线分析分为3组：PcS、PcSTGN－10；PcW、PcWTGN－10；PcH1、PcH1TGN－10、PcH2、PcH2TGN－10。非标记探针高分辨率熔解曲线分析将8种不同的 Pc 启动子分为4组 PcS， PcH1；PcH2， PcW；PcSTGN－10， PcH1TGN－10；PcH2TGN－10，PcWTGN－10。联合运用扩增子和非标记探针高分辨率熔解曲线分析可将8种不同的Pc启动子相互区分开，95株大肠埃希菌109个第1类整合子中，共检测出5种不同的Pc启动子PcS，PcW，PcH1，PcH2TGN－10，PcWTGN－10，与测序结果完全一致。结论本研究成功建立了一种基于非标记探针结合高分辨率熔解曲线分析的方法，用于快速区分第1类整合子可变区启动子，该方法结果准确、费用低，可用于临床对第1类整合子可变区启动子多态性的研究。（中华检验医学杂志，2017，40：95－100）
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HRM技术检测β-地中海贫血IVS-2-654(C＞T)与-28(A＞G)突变方法的建立及初步应用
目的 建立基于高分辨率熔解曲线(HRM)技术快速筛查β-地中海贫血(简称β-地贫)基因突变的方法,并初步探讨其临床应用价值.方法 选取温州地区人群β-地贫常见基因突变位点IVS-2-654(C＞T)与-28(A ＞G)作为研究位点,采用TA克隆技术构建其质粒DNA作为模板或基因分型对照,建立基于HRM技术检测β-地贫基因突变的方法,并对该方法的特异性、重复性、灵敏度等指标进行方法学评价.收集2009年11月至2010年10月温州医学院附属第二医院、育英儿童医院临床疑似β-地贫患者117例,抽取外周血标本,提取外周血白细胞DNA,用该方法进行IVS-2-654(C＞T)与-28(A ＞G)位点的HRM检测,并将检测结果与双向直接测序做比较.结果 建立的HRM技术可对β-地贫IVS-2-654(C＞T)与-28(A＞G)突变位点进行检测,未见非特异性扩增片段；不同基因型HRM检测的批内、批间熔解温度(Tm)值的变异系数(CV)均＜0.1％；该法低可检出103拷贝的DNA模板,并可检测低至10％的突变存在.117份临床疑似β-地贫患者样本经该法检测,45份为IVS-2-654(C＞T)杂合突变型,9份为-28(A＞G)杂合突变型,未发现2个位点的纯合突变型基因；此结果与直接测序所得基因型结果完全一致.结论 建立的HRM技术操作简便,特异性强,灵敏度高,可用于β-地贫基因突变筛查,并为β-地贫其他突变位点的检测及基因组单核苷酸多态性分型等提供了一个通用的技术平台.
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利用高分辨率熔解分析技术检测结肠癌发展过程中K-RAS及B-RAF V600E突变
目的 探讨K-RAS第12、13密码子及B-RAF V600E突变在结肠癌(CRC)演化不同阶段的分布情况及其与相关临床参数的关系.方法 临床回顾性研究.收集2011年1月至2012年1月于上海市长宁区中心医院进行肠镜检查患者130例,其中结肠息肉21例、腺瘤44例与肠癌65例,抽提DNA.建立使用带有高、低温内标的高分辨率熔解分析体系,检测上述DNA样本中的K-RAS第12、13密码子及B-RAF V600E突变,并使用Sanger测序法对K-RAS突变进行明确分型,使用Fischer确切概率法统计各突变在疾病演化不同阶段的分布及与癌组织体积大小、Dukes分期及瘤体分化情况等临床参数间的关系.结果 在息肉增生、腺瘤及癌组织中分别发现K-RAS突变2例、8例及26例,B-RAF突变1例、1例和2例.K-RAS突变率在息肉增生(9.5％)、腺瘤(18.2％)与癌组织(40％)中逐渐升高,且在腺瘤与癌组织中的差异具有统计学意义(P =0.013).K-RAS突变率在低分化癌中高于中、高分化癌(P=0.04),且第12密码子突变比率高于13密码子(P =0.028).所发现K-RAS突变主要类型为c.35G＞A、c.38G＞A、c.35G＞T与c.34G＞T.B-RAF突变率较低,在息肉、腺瘤与癌中分别为4％、2.3％与3.1％,且未发现同时存在K-RAS与B-RAF突变的病例.结论 在CRC演化过程中,K-RAS突变主要出现于腺瘤向癌转化过程.对CRC患者而言,进行K-RAS突变检测并进行明确分型对于判断肿瘤分化情况具有一定的辅助意义.
关键词： 结肠肿癌 原癌基因蛋白质B-raf 高分辨率熔解曲线 -
采用高分辨熔解曲线分析骨髓增殖性肿瘤患者外周血中钙网蛋白基因突变
目的 建立快速、准确、低成本的骨髓增殖性肿瘤(MPN)外周血钙网蛋白(CALR)突变的筛查方法.方法 采集2012至2016年确诊的70例MPN患者的外周血标本,应用PCR结合高分辨熔解曲线(HRM)对CALR突变进行筛查,阳性样本进一步采用Sanger测序和T-A克隆测序技术进行验证;选取CALR野生型DNA及1型和2型突变DNA,每天检测4次持续5 d,分别计算3种扩增片段熔解温度(Tm)的变异系数(CV).检测MPN患者的JAK2基因突变以比较JAK2和CALR突变的相关性.结果 采用PCR-HRM检测,在26例原发性血小板增多症(ET)和24例原发性骨髓纤维化(PMF)中分别筛查出7例(26.9%)和5例(20.8%)患者存在CALR突变,在20例PV中未见该突变;所有HRM 筛查阳性标本都经直接测序或T-A克隆测序证实.HRM 检测CALR野生型DNA及1型和2型突变DNA的 CV分别为1.91%、1.59%和1.43%.对所有样本进行JAK2突变检测发现47例存在JAK2 V617F突变和1例JAK2 exon12突变,未见同一样本JAK2与CALR突变共存.结论 PCR-HRM技术可实现CALR突变的快速筛查,结合测序可用于临床上对MPN患者的快速分子诊断.
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高分辨熔解曲线技术快速筛查 UGT1 A1基因变异
目的：利用高分辨熔解曲线技术，建立一种快速分子筛查UGT1A1基因缺陷相关的Gilbert （ GS）和Crigler－Najjar综合征（ CNS）的方法。方法方法学建立。临床收集的61例不明原因严重高胆红素血症的新生儿样本以待验证，有明确黄疸原因如ABO溶血，G6PD缺乏，败血症，缺血缺氧性脑病的黄疸儿除外。根据亚洲人群UGT1A1基因常见突变位点－G211A 、C686A、 C1091T、C1352T和T1456G，设计特异性HRM引物，建立和优化HRM反应条件。用优化的HRM方法对临床标本进行UGT1A1基因突变的筛查，所有的样本经测序进一步验证。结果 HRM检测方法能够准确地将有突变的样本与无突变的样本区分开来。经HRM 分子筛查，61例严重黄疸儿中，42例检出携带有UGT1A1突变，共检测出4种UGT1A1突变类型。结论本研究建立的PCR－HRM分型技术可以经济、简便、快速、有效的检测UGT1 A1基因异常，为临床诊断GS及CNS提供可靠的依据，也有利于UGT1A1基因相关疾病的大规模的分子流行病学研究。（中华检验医学杂志，2017，40：101－104）
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高分辨熔解曲线技术快速筛查SLC4A1基因c.166A>G突变
目的 探讨高分辨熔解曲线(HRM)技术对SLC4A1基因进行突变筛查的可行性.方法 选用DNA测序确认为c.166A>G(p.Lys56Glu)杂合突变的2例遗传性球形红细胞增多症(HS)和30份健康体检者标本,使用Primer Premier 6.0软件设计相应的HRM引物,在LightCycler? 480中进行检测和HRM分析.结果 应用HRM法能有效检测出2例HS的SLC4A1基因c.166A>G杂合突变,且其检测的特异度与敏感度皆为100%.结论 HRM技术能对SLC4A1基因c.166A>G进行突变筛查,为一种高效、准确和低成本的分子诊断方法.
