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维肝力对骨髓抑制小鼠骨髓及血清FL分泌水平的影响
目的:研究维肝力对骨髓抑制贫血小鼠骨髓及血清Flt 3配体(FL)分泌水平的影响,探讨维肝力在骨髓造血调控方面的作用.方法:制作骨髓抑制贫血小鼠模型,小鼠随机分为正常组、骨髓抑制贫血模型组、维肝力组(高、中、低剂量100,50,25 g·L-1);观察维肝力对骨髓抑制贫血小鼠外周血象、骨髓有核细胞(BMC)数的影响;通过酶联免疫吸附技术(ELISA)检测了骨髓抑制贫血小鼠骨髓及血清Flt3配体(Flt3 ligand,FL)的水平.结果:高剂量维肝力对粒细胞系、红细胞系、血红蛋白(Hb)及BMC均有显著的提高作用,中、低剂量维肝力对血小板促进作用更明显;维肝力组骨髓及血清FL水平均低于贫血组,其中高、中剂量组FL水平下降为显著.结论:维肝力对放、化疗所引起的小鼠骨髓抑制能起到一定的缓解作用.
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小鼠Flt3配体的原核表达及其在不同亚型树突状细胞制备中的应用
目的原核表达小鼠Flt3配体,分析其在不同亚型DCs体外诱导中的应用潜能,为不同亚型DCs的深入研究提供实验资料。方法 PCR扩增flt3l基因,构建pCold-flt3l质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3)诱导表达并纯化。重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blot分析,并用于小鼠骨髓源DCs的诱导制备,流式细胞术分析不同DC亚型相关分子标志以及CD40、CD80、CD86和MHCⅡ的表达,同时ELISA测定IL-12和IFN-α的表达。结果 SDS-PAGE结果表明目的蛋白成功表达,纯化后纯度达93.3%,Western blot结果表明其具备良好的免疫反应性。同时,该蛋白能诱导小鼠骨髓细胞分化为较高比例(约60%)的DCs,且包含cDCs( CD11c+CD45RA-)和pDCs( CD11c+CD45RA+)亚型；LPS刺激后2种DC亚型均上调CD40、CD80、CD86和MHCⅡ的表达,且分泌较高水平的 IL-12和IFN-α。结论本研究成功获得重组小鼠Flt3配体蛋白,可用于制备具有良好生物学功能的cDCs和pDCs亚型,为下一步研究提供基础材料。
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再生障碍性贫血骨髓及外周血高水平Flt3配体的来源及意义
目的研究再生障碍性贫血(AA)患者骨髓及外周血高水平FL(Flt3配体)的来源和影响因素.方法采用常规ELISA法测定AA患者骨髓和外周血FL含量,应用单色和双色免疫荧光标记流式细胞仪分析FL的分泌细胞及其受体Flt3的表达,并观察AA患者淋巴细胞经PHA激发后环胞菌素(CyA)对FL分泌的影响.结果AA患者骨髓和外周血FL含量显著升高,为正常的25倍以上,外周血和骨髓浓度无区别;正常人CD3+细胞内贮存有大量FL,而AA患者CD3+细胞以膜型FL为主,胞内基本无FL存在;淋巴细胞经PHA活化后可分泌FL,CyA可抑制FL的分泌.结论AA患者骨髓和外周血FL水平显著升高,主要由CD3+细胞产生.
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Flt3配体促进再生障碍性贫血患者淋巴细胞向TH1表型分化
目的探讨Flt3配体(FL)对再生障碍性贫血(AA)辅助性T细胞(TH)分化的影响及与造血功能衰竭的相关性. 方法应用流式细胞仪分析AA患者骨髓及外周血中TH亚群,并观察植物血凝素(PHA)和白细胞介素-2(IL-2)对AA患者TH亚群影响;体外培养研究FL对骨髓和外周血T细胞分化及细胞因子分泌的作用. 结果 AA患者骨髓及外周血中TH1细胞比例明显增高,且以急性AA更为显著(P＜0.01),TH1与TH2细胞比例失衡,TH1/TH2比例显著高于正常对照(2.1±0.8和1.4±0.7, P＜0.05);AA及正常人淋巴细胞经PHA和IL-2激发后TH1比例并无明显变化,而正常人骨髓细胞经与FL共同孵育10 d后,培养上清中IFN-γ含量增高,表型分析提示,除TH1细胞比例增加外,树突状细胞及自然杀伤细胞阳性率也有明显增加. 结论 FL通过树突状细胞诱导淋巴细胞向TH1表型分化,是AA造血功能衰竭的原因之一.
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Flt3配体对多器官功能障碍综合征小鼠脏器功能和结构的保护作用
目的 观察Flt3配体(Flt3L)对酵母多糖致多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)小鼠多脏器功能和结构损伤的防护作用.方法 采用腹腔注射酵母多糖的方法复制小鼠MODS模型.雄性C57BL/6小鼠随机分为正常组(n=10),MODS组(n=30)和Flt3L治疗组(n=30).MODS组在致伤后腹腔注入生理盐水;Flt3L治疗组在致伤后第5 d起腹腔注射FltG配体(5μg/kg),连续给药7 d.观察酵母多糖致伤12 d动物死亡率,检测各组血丙氨酸转氨酶活性(alanine aminotransforase activity,ALT)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和肌酐(creatinine,Cr)水平,外周血T淋巴细胞亚群变化,镜下观察致伤后12 d动物肝、肺、肾、心等脏器的组织病理学改变.结果 在酵母多糖致伤后12 d,MODS组小鼠死亡率迭18%,Flt3L治疗组的小鼠死亡率为7%.MODS组小鼠血浆AIT、BUN和Cr在伤后12 d升高,而同时间点经Flt3L治疗的小鼠血浆AIT、BUN和Cr趋于正常,明显低于MODS组.MODS组小鼠肝脏、肺脏、肾脏和心脏发生明显的病理改变,主要表现为脏器实质细胞多呈变性与灶状坏死改变,而Flt3L治疗组小鼠上述病变明显减轻.MODS组小鼠CD4+T细胞数目减少,而CD8+T细胞数目呈明显增高,CD4/CD8比值显著下降;而Flt3L治疗组CD4+T细胞数目增加恢复至正常水平,CD4/CD8比值较MODS组明显上调.结论 给予Flt3L可以改善机体免疫状态,降低MODS期动物的死亡率,减轻脏器功能和结构的损伤,对MODS期的脏器损伤具有保护作用.
关键词： 多器官功能障碍综合征 Flt3配体 树突状细胞 病理学 -
用pProEXHT载体进行人FLT3配体基因的表达与产物的亲和层析纯化
目的:探讨寡聚组氨酸多肽与目标蛋白融合基因的表达及其产物的金属离子螯合亲和层析纯化方法.方法:将人FLT3配体(FL)胞外段cDNA连入pProEXHT载体,转入大肠杆菌实现表达.分离包涵体并进行复性处理后,通过Ni2+离子螯合亲和层析纯化融合蛋白表达产物.结果和结论:6×组氨酸-FL融合蛋白的表达量约占菌体蛋白总量的15%,用Ni2+离子螯合亲和层析纯化表达产物,一次过柱的纯度可达90%以上,操作程序简便省时,是日后FL基因工程产品大规模制备的可行途径.
关键词： 色谱法 亲和 Flt3配体 蛋白纯化[文献标识识]A -
重组人Flt3配体对微血管内皮细胞的抗辐射作用研究
目的研究Flt3配体(FL)对人微血管内皮细胞系细胞(ECV)的抗辐射作用及其可能的作用机理.方法用流式细胞仪分析ECV表面Flt3受体的表达;用MTT法观察FL对受照射ECV增殖的影响;用Annexin V-PI方法测定细胞凋亡,用RT-PCR方法分析细胞凋亡基因bax和Bcl-2的改变.结果 ECV表达Flt3受体,FL能激发ECV增殖,ECV经15Gy的照射后,FL能有效地拮抗照射对ECV增殖的抑制作用;同时照射后ECV的bax基因表达增加,bcl-2基因表达轻度降低.FL通过抑制bax基因的表达,降低辐射引起的ECV细胞凋亡.结论 FL通过抑制细胞凋亡,减轻辐射引起的ECV的损伤,可能在辐射损伤患者造血微环境的保护中具有应用价值.
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Flt3配体联合其他细胞因子对受照射小鼠免疫系统的作用研究
目的研究Flt3配体(FL)在受照射小鼠免疫系统恢复中的作用.方法采用F-800血细胞自动计数仪行外周血细胞计数及白细胞分类计数,流式细胞仪分析外周血淋巴细胞表型.结果照射前应用FL或照射后联合应用FL、IL-11、EPO和G-CSF等细胞因子,能有效地促进受照小鼠外周血白细胞和淋巴细胞的恢复,对CD8+细胞的恢复作用尤为明显,同时使CD4+/CD8+细胞比值较早恢复正常,提高受照射小鼠的生存率.结论 FL不但能促进辐射损伤机体造血功能的恢复,对免疫系统的恢复亦具有重要的作用.FL单独或与其他细胞因子联合应用,对辐射损伤动物具有明显的防护和治疗效应.
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重组人Flt3配体联合其它细胞因子对免疫细胞的体外抗辐射作用研究
目的研究重组人Flt3配体(rhFL)及其他细胞因子在体外对免疫细胞的抗辐射作用及其可能机理.方法用流式细胞仪分析照射前后外周血单个核细胞(PBMC)表型及rhFL对受照射PBMC表型的影响.[3H]-TdR测定细胞的增殖能力.PBMC来源贴壁细胞经细胞因子诱导树突状细胞(DC),并观察辐射对诱导DC的影响及rhFL对DC的抗辐射效应;用PI-Annexin V、DNA Ladder分析细胞凋亡.结果 PBMC在体外经15 Gy照射后,CD8+、CD56+细胞明显减少,照射前细胞培养液中加入100 ng/ml rhFL,可促进CD56+细胞的恢复;照射前应用rhFL及照射后联合应用IL-2等细胞因子,可促进受照射CD8+、CD56+细胞的恢复;rhFL可协同GM-CSF、IL-4、TNFα产生DC,并使DC细胞的数量较常规方法诱导产生的数量增加6倍,而且rhFL对DC分化诱导的辐射抑制作用具有明显的抗性;rhFL可抑制照射所致的细胞凋亡.结论 rhFL单独或与其他细胞因子联合应用,对人外周血免疫细胞具有明显的抗辐射效应,这对辐射损伤机体免疫功能的调节和恢复具有重要的使用价值.
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CD+34脐血干细胞转染pIRES2-FL-IL-3后静脉移植对辐射损伤小鼠的影响
目的 观察CD+34脐血干细胞转染质粒载体pIRES2-FL-IL-3后静脉移植对辐射损伤小鼠的影响并探讨其机制.方法 质粒载体plRES2-FL-IL-3转染脐血CD+34干细胞,将其通过静脉移植到辐射损伤的小鼠体内(5×105个细胞/只,双表达组,12只),观察辐照后2、4和6周动物存活率及外周血象变化.6周时免疫荧光法检测实验小鼠脾脏CD34表达,RT-PCR法和Westem blot法进行IL-3和FL的mRNA和蛋白活性检测,另外3组为单纯CD+34细胞组(CD34组)、转染plRES2-IL-3CD+34细胞组(IL-3组)和转染pIRES2-FL CD+34细胞组(FL组),各组动物数均为12只.结果 CD34组、IL-3组和FL组动物6周存活率分别为25.0%、50.0%和50.0%,双表达组动物存活率为91.7%,显著高于其余各组.2周时双表达组白细胞数量、红细胞数量及血小板数量显著高于其余3组.双表达组脾脏CD34免疫荧光强度显著高于其余3组,IL-3及FL的mRNA水平及蛋白活性均显著高于其余3组.结论 真核共表达质粒载体plRES2-FL-IL-3转染CD+34脐血于细胞后对辐射损伤小鼠具有显著的促脾脏造血作用,其机制与移植后小鼠脾脏组织中移植CD+34脐血干细胞的聚集、增殖及目的 蛋白的高效表达有关.
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Flt3配体对多器官功能障碍综合征小鼠脾脏树突状细胞及细胞免疫功能的修复作用
目的 探讨Flt3配体(FL)对多器官功能障碍综合征(MODS)晚期免疫失衡的修复作用与意义.方法 按随机数字表法将90只实验鼠分为正常对照组、MODS组和FL治疗组,每组30只.用流式细胞技术检测各组脾脏树突状细胞(DC)、外周血单个核细胞主要组织相容性复合物Ⅱ类分子(I-Ab)表达变化及T细胞亚群变化,光、电镜下观察脾脏组织结构和DC变化.结果 MODS组脾脏中未成熟DC明显增加(P＜0.05);外周血单个核细胞I-Ab表达及CD4/CD8比值明显下降(P＜0.01和P＜0.05);脾脏白髓消散,脾小体明显减少,DC多呈凋亡与退变崩解改变,周围淋巴细胞大量凋亡;活杀前动物死亡率为18%.治疗组小鼠脾脏中成熟DC数量明显增加(P＜0.05);外周血单个核细胞I-Ab表达接近正常水平,CD4/CD8比值较MODS组明显上调;脾脏组织形态与DC的病理改变较MODS组明显减轻;实验鼠死亡率(7%)也明显降低.结论 FL可以通过促进DC增生和活化,有效改善MODS晚期细胞免疫功能,进而缓解MODS的进程.
关键词： Flt3配体 多器官功能障碍综合征 树突状细胞 耐受性树突状细胞 脾脏 -
人Flt3配体基因的克隆及在Hela细胞中的表达
目的:克隆人Flt3配体(FL)基因,检测其在Hela细胞中转录及表达蛋白的活性.方法:Trizol法提取K562细胞总RNA,经RT-巢式PCR得到FL的cDNA,PCR产物亚克隆入pGEM-T载体测序,构建pcDNA3/hFL.经Lipofectamine2000介导转入Hela细胞,RT-PCR法检测转染细胞中hFL基因的转录,ELISA法检测培养上清中hFL的含量,增殖和促生存实验鉴定hFL的活性.结果:所得FL基因序列正确.转染后的Hela细胞能转录FL基因,上清中hFL蛋白含量为56.8ng/ml/l,hFL能促Raji细胞生存及抑制凋亡(P＜0.01),促进HL-60细胞增殖(P＜0.05).结论:构建的pcDNA3/hFL质粒在Hela细胞表达系统中能够有效转录,表达的hFL蛋白具有生物学活性.
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Flt3配体胞外域的原核表达纯化及对脐血CD34+细胞的扩增作用
背景:Fms 样酪氨酸激酶3配体(Flt3配体)是一种重要的生长因子,通过激活特定的酪氨酸激酶受体,调控造血细胞的生长、生存和/或分化,具有促进造血干细胞体外扩增的应用潜力.目的:构建pET32a(+)-hFLext原核表达载体,表达、纯化hFLext蛋白,观察其对脐血CD34+细胞的扩增作用.方法:克隆hFLext,构建pET32a(+)-hFLext重组表达载体.转化大肠杆菌 BL21,IPTG诱导蛋白表达,镍珠亲合层析纯化蛋白.磁珠分选脐血CD34+细胞,单独加入hFLext或联合干细胞因子、血小板生成素孵育1周,观察体外扩增作用.结果与结论:成功克隆hFLext,并构建了pET32a(+)-hFLext重组表达载体.在大肠杆菌BL21成功表达Trx-hFLext融合蛋白,经8 mol/L尿素变性包涵体蛋白,逐步透析复性,镍珠亲合层析纯化蛋白,成功获得高纯度的Trx-hFLext融合蛋白.Trx-hFLext融合蛋白不仅具有维持及轻度刺激CD34+细胞体外扩增的作用,并且与干细胞因子及血小板生成素具有协同作用,为造血干/祖细胞体外扩增研究奠定了基础.
关键词： Flt3配体 CD34+ hFLext Trx-hFLext 载体 -
Flt3配体在肿瘤免疫治疗中的应用
肿瘤是一类严重威胁人类健康和生命的疾病,因此,有关肿瘤早期诊断和治疗一直是科学研究的热点问题.近年针对肿瘤患者的免疫监视功能缺损,以提高树突状细胞(DC)、T细胞及NK细胞介导的肿瘤免疫治疗为策略的癌症治疗方法已经取得了多项进展,基于Fh3配体(FL)免疫治疗就是其中之一.FL是主要表达于造血干细胞/祖细胞上的Ⅲ型酪氨酸激酶受体Flt3的配体,是一种与早期造血调控有关的生长因子.FL联合其他细胞因子,能够在体内外显著地扩增DC,刺激T细胞和NK细胞增殖,为肿瘤免疫治疗提供了良好的基础.目前采用FL治疗乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、颅内肿瘤等,已经显示了其在肿瘤免疫治疗领域中的良好临床应用前景.
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乙型肝炎病毒核心抗原及Flt3配体双表达核酸疫苗的小鼠免疫应答研究
目的构建乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)和Flt3配体(FL)胞外段双表达核酸疫苗,并观察其免疫原性.方法分别将HBcAg、FL基因克隆入pJW4303载体,获得双表达核酸疫苗,体外转染293T细胞检测目的基因的表达.分组免疫BABL/c小鼠,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清抗-HBc IgG效价,酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测HBcAg特异性Th1/Th2型细胞因子的分泌水平.结果所构建疫苗在体外均能表达HBcAg和FL,当基因位于内部核糖体切入位点(IRES)元件上游时表达水平明显较优.pJW4303/C/FL免疫组产生的抗-HBc IgG效价和Th1/Th2型细胞因子的分泌水平均显著优于pJW4303/C和pJW4303/FL/C组.结论成功构建双表达核酸疫苗,基因位于上游时表达水平高于下游.FL基因的引入明显增强了HBcAg核酸疫苗的免疫原性.
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FLT3配体研究进展
Fms样酪氨酸激酶受体3(FLT3)配体(FL)是一种与造血调控有关的早期造血生长因子,可与多种细胞因子协同作用.FL与FLT3结合后能够调节原始造血干/祖细胞增殖和分化,动员和刺激髓系及淋巴祖细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞和自然杀伤树突状细胞增殖和分化,是树突状细胞为重要的生长因子.本文就FL的主要生物学特性以及临床应用等方面的研究进展作一综述.
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重组人Flt3配体在大肠杆菌中的高效表达和生物学活性的鉴定
根据天然的人Flt3配体(Flt3 ligand,FL)基因和遵循适合大肠杆菌BL21(DE3)表达体系表达条件及不改变FL天然蛋白氨基酸序列的原则,对其进行改造,所获得的FL功能片段(FL134)克隆入PET30a表达载体,在C端融合了6个His,继而在大肠杆菌中诱导表达.结果表明重组蛋白rhFL134以包涵体形式在大肠杆菌(BL21)中可得到较高水平的表达.通过蛋白的变性、复性和HiTrapTM亲和层析获得了纯度达92%以上的rhFL134重组蛋白.体外的活性实验显示,重组蛋白rhFL134具有显著的促小鼠骨髓细胞的集落形成和扩增人脐带血中的CD34+细胞的生物学活性.
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Flt3配体在生物治疗中应用的研究进展
Flt3配体(Flt3 ligand,FL)是一种与造血调控有关的早期造血生长因子.FL与造血干细胞表面的Fm样酪氨酸激酶受体3结合,激活造血前体细胞,促进其增殖;与其他细胞因子联合应用,可显著提高造血效应.研究还证实,FL作为一种免疫佐剂,单独或者联合其他细胞因子能在体内外扩增树突状细胞(dendritic cells, DCs) ,促进其发育、成熟.树突状细胞是免疫系统中一类重要的专职抗原提呈细胞,能够摄取外来抗原,与自身的MHC 形成复合物,提呈给T 细胞,显著刺激抗原特异性T细胞反应,在肿瘤免疫治疗中发挥重要作用.和T细胞不同,NK细胞不需要抗原提呈细胞的作用,通过分泌干扰素等细胞因子能够直接杀伤肿瘤细胞;FL 联合其他细胞因子能够诱导NK前体细胞(pro-NK cell)的扩增和增殖,进而增强机体的抗肿瘤能力.目前FL已经被应用于造血系统疾病、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、肝脏肿瘤、神经系统肿瘤等疾病的基础或临床研究.此外,在抗感染、抗宿主移植以及自身免疫反应疾病等方面FL也有较好的作用.随着研究的不断深入,FL显示出了优越的生物学效应,展示了其在生物治疗领域中的广阔前景.
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重组腺病毒介导的FLT3配体和阿霉素联合治疗小鼠肝癌
目的:将重组腺病毒介导的FLT3配体(FLT3 ligand,FL)与阿霉素(adriamycin,ADM)联合治疗小鼠肝癌,探索基因治疗和化疗相结合治疗肿瘤的新方法.方法:构建携带鼠FL的重组腺病毒载体(AdmFL),单独用其或ADM以及两者联用对实验性肝癌小鼠进行治疗,观察抗肿瘤效果.结果:(1) FL+ADM组小鼠肝癌生长抑制率大值为56.5%,明显高于ADM组和FL组的27.5%和26.6%(P<0.01);(2) FL+ADM组小鼠早期死亡率为8.3%,明显低于ADM组的37.5%(P<0.01);FL+ADM组小鼠长期生存率为86.4%,明显高于ADM组和FL组的50.0%和41.5%(P<0.01).结论:(1)FL和ADM治疗小鼠肝癌具有协同作用, FL可显著增强化疗效果;(2)FL能明显降低化疗不良反应.
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Flt3配体潜在的临床应用前景
Flt3配体是新近克隆的早期造血生长因子,具有刺激造血和调节免疫的双重作用,在造血干细胞动员、保护大剂量放化疗对骨髓的损伤、激发有效的抗肿瘤免疫、诱导主动的移植免疫耐受和调节肠道黏膜免疫等多个方面均有很好的临床应用前景.
