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Pir-b基因慢病毒载体的构建和表达
本研究构建pir-b基因慢病毒载体并检测其在293T细胞中的表达.从小鼠的mRNA中钓取pir-b基因的开放阅读框,与测序载体连接,经过测序鉴定以后,构建含有pir-b基因的慢病毒穿梭质粒,与包装质粒一起共转染293T细胞,收获上清病毒浓缩纯化后转染293T细胞,用Western blot检测PIR-B蛋白的表达,同时以含有egfp基因的慢病毒作为转染效率的对照.结果表明:含有pir-b开放阅读框的慢病毒穿梭质粒构建成功,序列测定的结果与预期完全一致.含有pir-b的慢病毒载体包装成功.Western blot的结果证实外源PIB-B蛋白在293T细胞中正常表达.结论:本研究成功构建了含有pir-b基因的慢病毒载体,转染293T细胞以后正常表达PIR-B蛋白,这为以后深入研究pir-b在免疫调节中的作用奠定了坚实的基础,
关键词： 配对样免疫球蛋白受体B 慢病毒载体 耐受性树突状细胞 -
Flt3配体对多器官功能障碍综合征小鼠脾脏树突状细胞及细胞免疫功能的修复作用
目的 探讨Flt3配体(FL)对多器官功能障碍综合征(MODS)晚期免疫失衡的修复作用与意义.方法 按随机数字表法将90只实验鼠分为正常对照组、MODS组和FL治疗组,每组30只.用流式细胞技术检测各组脾脏树突状细胞(DC)、外周血单个核细胞主要组织相容性复合物Ⅱ类分子(I-Ab)表达变化及T细胞亚群变化,光、电镜下观察脾脏组织结构和DC变化.结果 MODS组脾脏中未成熟DC明显增加(P＜0.05);外周血单个核细胞I-Ab表达及CD4/CD8比值明显下降(P＜0.01和P＜0.05);脾脏白髓消散,脾小体明显减少,DC多呈凋亡与退变崩解改变,周围淋巴细胞大量凋亡;活杀前动物死亡率为18%.治疗组小鼠脾脏中成熟DC数量明显增加(P＜0.05);外周血单个核细胞I-Ab表达接近正常水平,CD4/CD8比值较MODS组明显上调;脾脏组织形态与DC的病理改变较MODS组明显减轻;实验鼠死亡率(7%)也明显降低.结论 FL可以通过促进DC增生和活化,有效改善MODS晚期细胞免疫功能,进而缓解MODS的进程.
关键词： Flt3配体 多器官功能障碍综合征 树突状细胞 耐受性树突状细胞 脾脏 -
耐受性树突状细胞预防和治疗卵清蛋白过敏小鼠的的研究
目的 比较腺病毒重组CTLA4Ig/α4β7诱导的耐受性树突状细胞对卵清蛋白(OVA)致敏小鼠的预防和治疗效果.方法 BALA/c小鼠32只,分为4组.基础致敏24h后回输耐受性树突状细胞为预防组；肠道激发4h后回输耐受性树突状细胞为治疗组；回输生理盐水为阴性对照组和OVA过敏小鼠为阳性对照组.观察各组小鼠过敏症状缓解情况；HE染色观察空肠形态；甲苯胺兰染色观察小肠固有层肥大细胞聚集及脱颗粒现象；ELISA测定各组血清中OVA特异性IgE水平.结果 与阳性对照组相比,治疗组小鼠OVA特异性IgE水平显著降低(0.25±0.05 vs 0.17±0.03) (P ＜0.05)；体重增长明显(3.16 g±0.75 g vs 5.04 g±0.49 g)(P ＜0.05)；腹泻症状减轻；HE染色可见治疗组小肠绒毛中上皮细胞局灶性坏死、脱落,固有层炎症细胞浸润现象明显改善；肥大细胞聚集和脱颗粒现象改善.而预防组较阳性对照组过敏症状、小肠形态学及OVA特异性IgE水平差异均无统计学意义.结论Ad CTLA4Ig/Adα4β7修饰的致耐受性树突状细胞对卵清蛋白过敏小鼠具有治疗作用而无预防作用.
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人外周血耐受性树突状细胞的诱导培养及其DC-STAMP的表达研究
目的:诱导培养人外周血耐受性树突状细胞(TolDCs)并动态观察TolDCs诱导过程树突状细胞-特异性跨膜蛋白(DC-STAMP) mRNA的表达水平.方法:(1)免疫磁珠分选法获得人外周血CD14+单核细胞,采用细胞因子GM-CSF、白介素4(IL-4)、地塞米松和LPS联合培养诱导TolDCs；(2)观察培养细胞的形态变化,流式细胞术检测CD83、CD86和CD14的表达,并将培养的细胞与T淋巴细胞共培养观察T淋巴细胞增殖反应；(3)采用实时定量PCR对TolDCs诱导培养过程中DC-STAMP mRNA表达水平进行动态观察.结果:(1) CD14+单核细胞GM-CSF、IL-4、脂多糖诱导培养后胞体变大,出现树枝状突起,为典型的成熟DCs形态,加地塞米松诱导培养后胞体亦变大,但未见明显树枝状突起,缺乏典型的成熟DCs形态；(2)CD14+单核细胞经GM-CSF、IL-4培养后使CD83和CD86表达上调,CD14表达下调,加Dex联合诱导培养后DCs表面CD83、CD86表达下调,CD14表达上调,与T淋巴细胞共培养后增殖反应明显减弱,显示TolDCs的免疫表型和功能特性；(3) CD14+单核细胞经GM-CSF、IL-4培养后DC-STAMP mRNA的表达水平随培养时间延长而降低,加入地塞米松联合诱导后表达水平明显增加.结论:人外周血CD14+单核细胞采用GM-CSF、IL-4和地塞米松联合培养可诱导TolDCs生成,DC-STAMP可能与DCs的致耐受功能有关.
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肝X受体激动剂诱导获得的小鼠耐受性树突状细胞与天然耐受性树突状细胞的比较
目的 通过与天然耐受性树突状细胞(N-tDCs)比较来探讨肝X受体(LXR)激动剂诱导获得的小鼠耐受性树突状细胞T-tDCs的免疫耐受特性.方法 获取小鼠骨髓来源单个核细胞,以白细胞介素(IL)-4和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)辅以LXR激动剂(T0901317)诱导7d后,检测细胞表型、进行混合淋巴细胞反应、调节性T细胞(Tregs)体外诱导实验等;或继续以脂多糖(LPS)诱导其成熟,进行表型分析.利用BALB/c DO11.10 RAG-/-小鼠来源的CD4+T细胞进行Tregs诱导实验,并与磁珠阴性分选从小鼠脾脏获得CD4+ DCs (N-tDCs)进行对照研究.结果 与N-tDCs比较,T0901317诱导7d时的T-tDCs形态更接近普通DCs,CD80、CD86、MHC-Ⅱ类分子表达略低,但均为中低表达,CCR7表达水平相近.N-tDCs具有更强的抑制能力,当特异性抗原鸡卵清白蛋白(OVA)存在时,N-tDCs可以更强地诱导Tregs的生成,而T-tDCs可以分泌更高水平的IL-10.结论 T-tDCs与N-tDCs以不同的方式发挥免疫抑制作用.
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肝X受体对小鼠耐受性树突状细胞的诱导作用
为研究肝X受体(LXR)对小鼠骨髓来源耐受性树突状细胞的诱导作用,取C57BL/6纯系小鼠股骨骨髓,将骨髓细胞置于含rmGM-CSF(20 ng/ml)、rmIL-4(20 ng/ml)、10％ FBS、含／或不含LXR激动剂TP0901317(5μmol/L)的RPMI1640培养基中生长.于第7天时检测细胞表型,指标包括:CD11c、CD80、CD86、MHCⅡ、CCR7、PD-L1等;同日加入LPS(100 ng/ml)促成熟.LPS作用第3天时,检测细胞表型.以MACS分选未成熟和成熟CD11c+细胞,以丝裂霉素C处理细胞.另取BALB/c小鼠脾脏,MACS分选CD4+T淋巴细胞.将CD11c+细胞与CD4+T细胞混合培养,CCK-8法检测T细胞增殖情况.ELISA法检测细胞培养上清中IL 10水平.研究发现,TP0901317处理组:培养第7天时,CD11c+细胞约为70.2％;CD80、CD86和MHCⅡ在CD11c+细胞上为中低表达,表达水平在40.2％～50％; CD11c+CCR7+细胞约占78％; CD11c+ PD-L1+细胞约占90％.以LPS处理促成熟第3天时,CD11c+细胞约为85％;CD80、CD86和MHCⅡ在CD11c+细胞上的表达水平没有明显差异;CD11c+ CCR7+细胞约占86％; CD11c+ PD-L1+细胞约占99％.混合淋巴细胞反应显示,TP0901317处理组:成熟CD11c+细胞与未成熟细胞一样,均没有刺激CD4+T细胞增殖的能力.而在dTP0901317未处理组:成熟CD11c+细胞具有很强的刺激CD4+T细胞增殖的能力.ELISA检测结果显示,与TP0901317未处理组比较,TP0901317处理组CD11c+细胞能够产生更高水平的IL-10,具有显著意义(P＜0.05).故而可以认为LXR活化能够诱导小鼠骨髓细胞向耐受性树突状细胞分化.
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耐受性树突状细胞与自身免疫性疾病关系
树突状细胞(Dendritic cell,DC)是具有典型树突状形态、膜表面高表达主要组织相容性复合体Ⅱ(MHC-Ⅱ)类分子、能移行至淋巴器官和刺激初始型T细胞增殖活化的细胞,是递呈肿瘤抗原能力强的抗原递呈细胞(APC).
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耐受性树突状细胞对再生障碍性贫血小鼠骨髓造血功能的影响
目的 探讨小鼠骨髓单个核细胞培养出的耐受性树突状细胞(tDCs)输注对免疫介导性再生障碍性贫血模型小鼠骨髓造血功能的影响.方法 采用昆明小鼠30只,参照姚军等方法建立免疫介导性再生障碍性贫血模型,实验分模型组、tDCs组、照射组、正常组.tDCs组分别于制模后0d、3d、5d从小鼠尾静脉输注耐受性树突状细胞1×106/只,观察各组小鼠外周血象变化、濒死时(或造模28d时)骨髓有核细胞数量和骨髓病理学特征.结果 模型组外周血WBC显著低于tDCs组和照射组,分别为(0.7±0.2)×109/L,(4.27±0.64)×109/L,(5.89±0.34)×109/L.tDCs组小鼠单侧股骨有核细胞数量显著高于模型组,而与照射组结果一致.结论 tDCs输注可减轻再生障碍性贫血模型小鼠骨髓造血衰竭程度.
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耐受性树突状细胞在免疫耐受调节机制作用中的研究进展
树突状细胞(dendiitic cell,DC)是具有典型树突状形态、膜表面高表达组织相容性复合体Ⅱ(major histocompatibility complexⅡ,MHC-Ⅱ)类分子、能移行至淋巴器官并刺激初始型T细胞增殖活化的细胞,是体内重要的抗原提呈细胞,在免疫调节中扮演着免疫应答和免疫耐受的双重角色[1],对维持机体免疫平衡起重要作用.
