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慢病毒荧光素酶载体介导的miRNA靶向基因筛选系统的建立及应用
本研究旨在建立miRNA靶基因高通量筛选系统,筛选出能调控p21NAs,以便试验验证及探索这些miRNA的生物学功能及意义.利用分子克隆技术构建并鉴定2个慢病毒表达载体-pWPXL-Luc及pWPXL -Luc -P21-3 'UTR,分别与包装载体psPAX-2及PDM2G共转染HEK 293T细胞；包装病毒颗粒,感染HEK 293细胞,获得稳定单表达荧光素酶及共表达荧光素酶与P21-3'UTR的细胞株,前者在后续实验中作为对照；采用荧光素酶检测试剂检测pWPXL-Luc病毒感染后的293细胞的荧光素酶活性.结果表明:包装出高滴度的病毒颗粒,成功建立稳定株,且在一定范围内稳定株细胞的荧光素酶活性与细胞数目成正比.结论:成功建立了miRNA靶基因高通量筛选系统；利用本筛选系统,成功筛选出靶向细胞周期调控基因P21( CIP1/WAF1)的miRNA.
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FLT3基因3'-非翻译区-荧光素酶报告载体的构建及其活性鉴定
为分析FMS样酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinase 3,FLT3)基因3'-非翻译区(3'-untranslated region,3'-UTR)可能的微小RNA(miRNA)调控位点,构建FLT3基因3'-UTR-荧光素酶报告载体,与miRNA共转染293T细胞,分析miRNA对其调控作用.采用PCR方法从HepG2细胞基因组DNA中扩增FLT3基因3'-UTR区序列,插入经PstI和FcoRI双酶切的经过改造的荧光素酶报告载体pGL3-control(pGL3-control-m);通过Target Scan 5.1软件预测可能与FLT3基因3'-UTR作用的miRNA;采用FuGENE(R) HD转染试剂包裹荧光素酶报告重组子和miRNA真核表达载体共转染293T细胞,双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性.结果表明,成功构建了含有804 bp的FLT3基因3'-UTR序列的荧光素酶报告重组子,通过酶切和基因测序的方法鉴定正确;miRNA靶位点预测显示,FLT3基因3'-UTR可能是miRNA-15a、miRNA-15b、miRNA-16、miRNA-195、miRNA-424、miRNA-497的作用靶点;与对照组相比,miRNA-15a、15b、195可使荧光素酶报告重组子的荧光素酶活性降低20%左右.结论:成功构建了FLT3基因3'-UTR-荧光素酶报告载体,而niRNA-15a、miRNA-15b、miRNA-195可抑制其荧光素酶活性.
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小鼠β-catenin基因3'端非编码区荧光素酶报告载体的构建及其与miR-200a靶向调控关系的研究
目的 构建小鼠β-catenin基因野生型及突变型重组荧光素酶报告质粒和小鼠miR-200a过表达质粒,验证miR-200a与β-catenin的靶向调控关系.方法 采用生物信息学方法预测miR-200a与β-c ate nin基因的结合位点.采用PCR法扩增小鼠β-catenin基因3'端非编码区(3'UTR)片段和pre-miR-200a基因片段,分别克隆至pGL3-control载体和p Le nti-CMV-EG FP载体,构建野生型及突变型重组荧光素酶报告质粒.293T细胞分为6组,分别将野生型与突变型荧光素酶质粒与miR-200a过表达质粒以及对照质粒共转染,检测6组细胞中荧光素酶的活力.结果 电泳和测序结果证实成功构建小鼠β-c ate nin基因野生型和突变型重组荧光素酶报告质粒以及miR-200a过表达质粒;双荧光素酶活力检测结果显示,野生型实验组相对荧光素酶活力均低于野生型对照组和阴性对照组,且差异有统计学意义(P＜0.05).结论 成功构建小鼠β-catenin基因野生型和突变型重组荧光素酶报告质粒以及miR-200a过表达质粒,miR-200a可以靶向抑制β-catenin的表达.
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PSA启动子荧光素酶报告载体的建立及活性鉴定
目的:建立高活性的PSA启动子荧光素酶报告载体.方法:提取前列腺癌细胞PC-3总DNA,PCR扩增出PSA启动子片段,建立PSA启动子荧光素酶重组载体PGL3-psap,通过脂质体介导将重组载体转染到前列腺癌细胞PC-3中,使用荧光素酶检测系统检测其活性.结果:DNA测序结果表明成功构建荧光素酶重组载体PGL3-psap,荧光素酶检测显示重组载体在前列腺癌细胞PC-3中有较强活性.结论:本研究成功构建了具有高度活性的PSA启动子荧光素酶报告载体,为进一步研究前列腺癌的诊断和治疗提供了实验基础.
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SOCS3基因3′端非翻译区荧光素酶报告载体的构建及活性鉴定
目的:研究细胞因子信号抑制蛋白-3(suppressors of cytokine signaling-3,SOCS3)基因3′端非翻译区(3′-untranslated region,3′-UTR)微小RNA(microRNA,miRNA)的调控作用,构建重组SOCS3基因3′-UTR荧光素酶报告载体,并通过荧光素酶活性测定,初步分析可能调控SOCS3基因表达的miRNAs.方法:采用PCR方法从原代培养的小鼠星形胶质细胞基因组DNA中扩增SOCS3基因3′-UTR序列,插入荧光素酶报告载体pGL3-Promoter,获得重组载体pGL3-Promoter/SOCS3;通过Target Scan5.2、RNAhybrid 和FINDTAR3软件预测可能与SOCS3基因3′-UTR结合的miRNAs;将pGL3-Promoter/SOCS3重组质粒和miRNAs共转染HEK 293T细胞,测定SOCS3 3′-UTR荧光素酶的活性.结果:酶切及核酸测序证实,成功构建了SOCS3基因3′-UTR序列的荧光素酶报告重组子;miRNA靶位点预测显示,SOCS3基因可能是miR-203、miR-291a-5p、miR-9、miR-140和miR-130b的作用靶标;与对照组相比,miR-203、miR-291a-5p、miR-140能使SOCS3 3′-UTR荧光素酶的活性显著降低.结论:成功构建了SOCS3 基因3′-UTR荧光素酶报告载体,且miR-203、miR-291a-5p、miR-140可显著降低其荧光素酶的活性.
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调控人脑胶质瘤中ezrin表达的miRNAs筛选及鉴定
目的:探讨调控人脑胶质瘤中ezrin的miRNAs筛选及鉴定.方法:针对ezrin的测序序列,在线使用TargetScan、PI-TA、MicroRNA.org、miRGator v2.0、miRDB等5种生物信息学软件预测分析可能调控ezrin的miRNA分子,运用荧光素酶报告载体实验检测筛选候选miRNA分子,RT-PCR检测11例胶质瘤组织和10例正常组织中候选miRNA分子mRNA的表达.结果:5种生物信息学软件预测出819个可能调控ezrin的miRNAs,根据评分结果同时结合目前国内外研究成果筛选出miR-148a、-204、-205、-34b、-370、-376b、-377、-410、-495、-548a-3p、-630和-96等12个miRNAs.双荧光素酶质粒与ezrin 3′-UTR作用位点突变体实验,证实hsa-miR-204与相应作用位点突变体EZR 204 Mutant无明显作用(P>0.05),RT-PCR结果显示miR-204在脑胶质瘤组织中的表达低于正常脑组织,差异有统计学意义(P<0.01).结论:胶质瘤组织中miR-204可通过靶向调控ezrin表达发挥生物学作用.
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小鼠MIA3基因3'-UTR区荧光素酶报告载体的构建及鉴定
目的 建立靶向miR-374b的MIA3 psicheck2野生型及突变型载体,为双荧光素酶报告实验提供前期保障. 方法 构建MIA3 psicheck2野生型及突变型载体,首先根据小鼠MIA3-3 'UTR序列信息设计其扩增引物,以小鼠血液全血基因组DNA为模板PCR扩增MIA3-3 'UTR序列,并将其克隆至psicheck2双荧光素酶报告载体中.然后,设计突变引物将miR-374b种子序列靶标TATTATA突变成AAATTAT构建突变载体.其次,采用载体酶切鉴定及测序法对构建的载体进行鉴定. 结果 琼脂糖电泳分析,载体PCR扩增大小与理论大小相符合.DNA测序鉴定MIA3-3 'UTR-WT载体构建成功.突变型载体的构建,成功将miR-374b种子序列靶标TATTATA突变成AAATTAT. 结论 载体的成功构建,为进一步鉴定miR-374b与成软骨分化相关靶基因MIA3是否真正具有结合位点奠定了基础.
关键词： 黑色素瘤活性抑制蛋白 微小RNA 3'端非翻译区 荧光素酶报告载体 软骨分化 -
稳定表达人BACE1启动子及荧光素酶报告基因HEK293细胞株的建立
目的 对人β位点裂解酶-1(BACE1)基因核心启动子进行克隆,构建携带BACEI基因启动子的荧光素酶报告载体,筛选稳定表达细胞株并分析其转录活性.方法 提取人胚肾HEK293细胞基因组DNA,以其为模板,PCR扩增BACE1核心启动子(-691～+67)并克隆至荧光素酶报告载体pGL4.21中,构建BACE1基因启动子荧光素酶报告载体pGL4.21-BACE1,将其转染HEK293细胞(无启动子的pGL4.21载体作阴性对照),利用嘌呤霉素筛选稳定表达株后检测其转录活性.结果 成功扩增到758 bp的BACE1核心启动子,pGL4.21-BACE1载体经双酶切鉴定正确;HEK293细胞被该载体转染后经嘌呤霉素筛选得到6株稳定表达BACE1启动子的细胞株,其转录活性分别是对照组(HEK293/pGL4.21)的(134.7±22.3)、(634.0±13.9)、(437.6±6.1)、(805.5±5.5)、(492.8±59.1)、(1 021.1±46.6)倍(P=0.001).结论 成功构建了人BACE1基因启动子荧光素酶报告载体.
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稳定表达人α-分泌酶adam10基因启动子荧光素酶报告基因细胞系的构建研究
目的 构建携带adam10基因启动子的荧光素酶报告载体,筛选稳定表达细胞系并分析其活性.方法 提取人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)基因组DNA,以其为模板,PCR扩增adam10基因启动子并克隆至荧光素酶报告载体pGL4.17中,构建adam10基因启动子荧光素酶报告载体pGL4.17-adam10,将其转染SH-SY5Y细胞(无启动子的pGL4.17载体作阴性对照,带有CMV启动子的pGL4.51载体作阳性对照),经G418进行稳定表达株的筛选,用1μmol/L维甲酸处理细胞4d后检测其荧光活性.结果 成功扩增到438 bp的adam10基因启动子,pGL4.17-adam10经PCR和双酶切鉴定均正确.SH-SY5Y细胞被该载体转染后经G418筛选得到稳定表达adam10基因启动子的细胞株,经检测具有较强的转录活性;1μmol/L雏甲酸能诱导adam10基因启动子高效表达.结论 成功构建了人adam10基因启动子荧光素酶报告载体,adam10基因启动子在SH-SY5Y细胞中能稳定表达,为深入研究adam10基因的表达调控、多态性分析及其高通量药物筛选提供基础.
关键词： 去整合素和金属蛋白酶10 启动子 荧光素酶报告载体 高通量药物筛选 -
水通道蛋白8基因3’-非翻译区荧光素酶报告载体的构建及其活性鉴定
[目的]构建水通道蛋白8(AQP8)基因3’-UTR荧光素酶报告载体,与microRNA (miRNA)共转染HT29细胞,分析miRNA对其调控作用.[方法]以HT29细胞基因组DNA为模板PCR扩增AQP8基因3’-UTR序列,并将其克隆到荧光素酶报告载体pGL3M上；根据生物信息学软件Targetscan和miRanda预测可能与AQP8基因3’-UTR作用的miRNA,将pGL3-AQP8 3’-UTR和预测miRNA共转染,利用双荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性.[结果]成功构建AQP8基因3’-UTR序列荧光素酶报告载体；生物信息学软件预测miRNA靶点显示AQP8基因3’-UTR可能是miR-214、miR-15a、miR-330、miR-137、miR-32、miR-612、miR-200a/141、miR-16的作用靶点；与对照组相比,miR-15a、miR-330、miR-32、miR-612、miR-200a、miR-16可使荧光素酶活性降低10％ ～45％.[结论]成功地构建AQP8基因3'UTR荧光素酶报告载体,miR-15a、miR-330、miR-32、miR-612、miR-200a和miR-16可抑制其荧光素酶活性.
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PrLZ基因3'-UTR区荧光素酶报告基因载体的构建及活性检测
目的 分析前列腺亮氨酸拉链(PrLZ)基因3'非编码区(3' UTR)可能的微小RNA (miRNA)调控位点,构建PrLZ基因3-UTR荧光素酶报告载体,为研究PrLZ基因转录后的miRNA调控提供有效的工具.方法 使用PCR方法从PrLZ阳性的C4-2细胞中扩增含PrLZ基因3'-UTR区序列,插入到T-Vector载体上,提高PCR产物的连接、克隆效率,通过Xbal和BamHI限制性内切酶双酶切后将其连入经相同内切酶双酶切后的荧光素酶报告基因载体pLUC中,构建pLUC-PrLZ 3'-UTR载体,使用生物信息学方法预测PrLZ基因3'-UTR可能是miR-34a的作用靶点,使用慢病毒载体构建对照载体(质粒名称NC)和过表达miR-34a(质粒名称miR-34a),包装成病毒颗粒后分别感染293 T细胞,然后通过X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent转染试剂将pLUC空质粒和pLUC-PrLZ 3'-UTR重组质粒分别转染293-T细胞,Promega试剂盒测定荧光素酶的活性.结果 得到含PrLZ基因3'-UTR序列的荧光素酶报告重组质粒,并用凝胶电泳和基因测序的方法验证了其序列的正确性.在miR 34a高表达组的293-T细胞中,重组质粒组荧光素酶活性比空质粒组低40％,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 成功构建PrLZ基因3'-UTR荧光素酶报告载体,miR 34a可以显著降低荧光素酶的活性,PrLZ基因3'-UTR上可能有miR-34a的调控作用靶点.
