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FLT3基因3'-非翻译区-荧光素酶报告载体的构建及其活性鉴定
为分析FMS样酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinase 3,FLT3)基因3'-非翻译区(3'-untranslated region,3'-UTR)可能的微小RNA(miRNA)调控位点,构建FLT3基因3'-UTR-荧光素酶报告载体,与miRNA共转染293T细胞,分析miRNA对其调控作用.采用PCR方法从HepG2细胞基因组DNA中扩增FLT3基因3'-UTR区序列,插入经PstI和FcoRI双酶切的经过改造的荧光素酶报告载体pGL3-control(pGL3-control-m);通过Target Scan 5.1软件预测可能与FLT3基因3'-UTR作用的miRNA;采用FuGENE(R) HD转染试剂包裹荧光素酶报告重组子和miRNA真核表达载体共转染293T细胞,双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性.结果表明,成功构建了含有804 bp的FLT3基因3'-UTR序列的荧光素酶报告重组子,通过酶切和基因测序的方法鉴定正确;miRNA靶位点预测显示,FLT3基因3'-UTR可能是miRNA-15a、miRNA-15b、miRNA-16、miRNA-195、miRNA-424、miRNA-497的作用靶点;与对照组相比,miRNA-15a、15b、195可使荧光素酶报告重组子的荧光素酶活性降低20%左右.结论:成功构建了FLT3基因3'-UTR-荧光素酶报告载体,而niRNA-15a、miRNA-15b、miRNA-195可抑制其荧光素酶活性.
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AQP4基因多态性与NMO临床表型的相关性分析及功能研究
目的 探讨水通道蛋白4(AQP4)基因多态性与国人视神经脊髓炎(NMO)发病的遗传相关性及分子机制.方法 收集2010年1月至2014年1月在中山大学附属第三医院神经科就诊的血清AQP4抗体(NMO-IgG)阳性的NMO患者111例及NMO谱系疾病(NMOSD)患者97例和健康对照204名作为研究对象.首先,选择AQP4基因调控区的8个单核苷酸多态性位点(SNP)进行基因分型;之后,通过关联分析SNP基因基因型与NMO临床表型的相关性;后,利用双荧光素酶检测技术验证3'-非翻译区(3'-UTR)SNP位点的碱基改变对小分子RNA (miRNA)调控作用的影响.结果 AQP4基因3 '-UTR区rs1058424的A/T基因型(50.61％比70.45％,OR=0.430,95％ CI 0.210～0.880)和rs3763043的C/T基因型(50.00％比68.18％,OR=0.467,95％ CI 0.231 ～0.994)与长节段脊髓炎,3'-UTR区rs1058424的A/T基因型(46.72％比66.28％,OR=0.525,95％ CI0.276～0.999)、rs335929的A/C基因型(45.08％比58.14％,OR=0.527,95％ CI0.281 ～0.987)和启动子0区rs151244的C/T基因型(50.82％比69.77％,OR=0.450,95％ CI 0.230 ～0.881)与视神经炎,3'-UTR区rs6508459及内含子区rs3763040基因型与合并系统性自身免疫性疾病存在相关性(P分别为0.012和0.023);miRNA 323-3p对AQP4基因表达有调控作用,但3'-UTR区rs1058424碱基改变并不影响miRNA 323-3p对AQP4基因的调控.结论 AQP4基因3'-UTR区的SNP与国人NMO临床表型具有相关性.miRNA 323-3p可能通过与AQP4基因3'-UTR区某一特定SNP位点结合起调节作用,从而参与NMO发病.
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先天性心脏病相关致病基因调控区变化的研究进展
先天性心脏病是指出生前就存在心脏及大血管结构或功能异常的一类疾病,严重威胁儿童健康.遗传因素在先天性心脏病发生发展中占据重要地位.越来越多的研究表明,除了基因编码区异常与先天性心脏病发病相关以外,先天性心脏病相关致病基因调控区变化也参与其发生.调控元件主要包括启动子、增强子、衰减子等.该文就调控区功能元件的变化与先天性心脏病发生关系进行综述,以期进一步阐述其发病机制,为临床诊疗提供新思路.
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Resistin基因3'非翻译区ATG序列多态性与2型糖尿病的相关性研究
目的 研究resistin基因3'-非翻译区ATG重复序列在2型糖尿病(T2DM)患者及正常血糖人群中的多态性分布,探讨此重复序列与T2DM的相关性.方法 选取东北地区汉族T2DM患者243例,正常对照110例,采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)方法初筛基因后,进行DNA直接测序.结果 在353例受试者中,检测到resistin基因3'非翻译区ATG重复序列有3种基因型,表现为T2DM患者中a型ATG序列重复6次,共有220例,频率为90.5%;b型ATG序列重复8次,共有10例,频率为4.1%;c型ATG序列重复7次,共有13例,频率为5.4%.在110例正常人中均表现为重复6次的a型ATG序列,不存在b型及c型的基因型.结论 Resistin基因3'非翻译区ATG序列在T2DM患者及正常人群中的多态性分布存在差异,其多态性分布与T2DM的易感性相关,可能是东北地区汉族人群发生T2DM的一个重要的相关因素.
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盐藻cbr基因启动子及其3'-非翻译区序列的克隆
目的:克隆盐藻cbr基因启动子和3'-非翻译区(3'UTR)片段.方法:设计2对引物,通过2轮巢式PCR反应,扩增cbr基因启动子,其中首轮PCR反应使用改良的降落PCR程序,第二轮巢式PCR反应的模板是第一轮PCR产物,使用普通PCR程序;cbr基因3'-UTR片段的克隆采用一对引物,通过一般PCR程序得到.结果:通过巢式PCR得到长约1.1kb的cbr基因启动子片段,DNA测序结果表明碱基序列与文献记载完全相同,无任何碱基突变;克隆的长0.3kb的cbr基因3'-UTR片段经人工比较,与收录的序列吻合,无碱基突变.结论:利用普通Taq酶对用PCR方法克隆得到了盐藻胡萝卜素生物合成相关基因cbr的2个基因表达调控序列;结合使用巢式PCR和改良降落PCR,可以非常有效地克隆具有复杂二级结构的DNA片段;通过两端人工添加的限制序列,将cbr基因启动子和3'-UTR 2个调控片段构建到同一个载体上,形成cbr基因表达盒,为构建转基因盐藻表达载体打下了基础.
关键词： 盐藻 胡萝卜素生物合成相关基因 启动子 3'-非翻译区 -
人HOXA13'-非翻译区荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定
目的:针对人同源异型盒A1(HOXA1)基因的3'端非翻译区(3'-untranslated region,3'-UTR)构建HOXA1的荧光素酶报告基因载体,对其克隆进行鉴定并挑选出正确的克隆,为后续功能研究提供基础.方法:PCR扩增包含HOXA1 3'-UTR的DNA片段,克隆至荧光素酶载体psiCHECK-2,构建HOXA1 3'-UTR荧光素酶报告基因载体,经Not I和Xho I双酶切后测序进行鉴定.结果:克隆获得的DNA片段大小及序列与GenBank报道的一致,且插入方向正确.结论:成功构建了含hURAT1基因3'UTR区的荧光素酶报告载体,可用于后续功能研究.
