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慢病毒荧光素酶载体介导的miRNA靶向基因筛选系统的建立及应用
本研究旨在建立miRNA靶基因高通量筛选系统,筛选出能调控p21NAs,以便试验验证及探索这些miRNA的生物学功能及意义.利用分子克隆技术构建并鉴定2个慢病毒表达载体-pWPXL-Luc及pWPXL -Luc -P21-3 'UTR,分别与包装载体psPAX-2及PDM2G共转染HEK 293T细胞；包装病毒颗粒,感染HEK 293细胞,获得稳定单表达荧光素酶及共表达荧光素酶与P21-3'UTR的细胞株,前者在后续实验中作为对照；采用荧光素酶检测试剂检测pWPXL-Luc病毒感染后的293细胞的荧光素酶活性.结果表明:包装出高滴度的病毒颗粒,成功建立稳定株,且在一定范围内稳定株细胞的荧光素酶活性与细胞数目成正比.结论:成功建立了miRNA靶基因高通量筛选系统；利用本筛选系统,成功筛选出靶向细胞周期调控基因P21( CIP1/WAF1)的miRNA.
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大鼠Nrn1基因3'UTR克隆及序列分析
目的 neuritin(Nrn1/Cpg15)是一种神经突起生长因子,在神经修复过程中发挥着重要作用.本文旨在探讨miRNAs调控Nrn1基因表达的潜在性.方法 采用PCR技术克隆大鼠Nrn1基因的3'UTR片段,同时利用MiRanda、DNAMAN软件对Nrn1基因序列及miRNA结合位点进行生物信息学分析.结果 成功克隆了649bp的Nrn13'UTR核心区段；Nrn1基因在不同物种间的序列同源性呈高度保守.MiRanda靶标预测结果表明miR204在3'UTR结合位点处高度保守,分值和能值较高,具有很强的潜在性.结论 Nrn1基因3'UTR在不同物种间序列保守性较高,miRanda软件预测miR-204结合位点处序列高度保守,进一步暗示Nrn1基因表达可能受到miR-204的调控.
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环氧合酶2mRNA3'UTR荧光素酶报告基因载体的构建
目的:通过构建环氧合酶2( COX2)mRNA 3'UTR的全长及其截短体荧光素酶报告基因载体,为研究COX2基因在炎症条件下的的转录后调控提供有效的工具.方法:通过从胃癌细胞SGC-7901提取RNA,反转录成cDNA后,以此为模板,PCR扩增COX23’非翻译区(3’-UTR)全长及截短的序列,并将该序列连接到荧光素酶报告基因载体pGL3-control,构建pGL3-COX2 3'UTR全长及pGL3 -COX23' UTR不同截短体.测序后将上述载体分别与pRL-TK载体共转染293-T细胞,48 h后裂解细胞检测荧光素酶的活性.后通过ELISA检测在IL-1β的刺激下COX2的下游产物PGE2的表达,并再次测定pGL3-COX2 3' UTR全长的荧光素酶活性.结果:成功构建了pGL3-COX2 3'UTR全长及pGL3 -COX23’UTR不同截短体,荧光素酶报告系统表明COX2 3 'UTR对基因表达具有较强的调控作用.而在炎症因子IL-1β的刺激下,pGL3-COX2 3'UTR全长荧光素酶的活性明显升高.结论:成功构建了COX2 mRNA 3’UTR荧光素酶报告基因载体并证明在IL-13的刺激下COX2表达上调,参与转录后调控.
