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Speedy A蛋白调控相关miRNA的筛选及miR-23b靶标的验证
目的 筛选和鉴定调控Speedy A蛋白表达的miRNAs. 方法 通过在线数据库TargetScan、miRNA和miR-walk预测与Speedy A相互作用的miRNAs,并结合本实验室前期建立的精原细胞和精母细胞小RNA数据库,筛选出评分较高的候选miRNAs.实时定量PCR检测小鼠7、14、21、35、64 d睾丸中候选miRNAs和Speedy A基因的表达,筛选出表达趋势呈显著负相关的miRNAs.构建野生型Speedy A基因3’端非翻译区荧光素酶报告基因载体(WT-Speedy A-3,UTR)及miR-23b靶序列突变型载体(mut-Speedy A-3'UTR),分四组转染HEK-293T细胞株:野生型实验组,WT-Speedy A-3,UTR质粒+miR-23b mimic;野生型对照组,WT-Speedy A-3'UTR质粒+miR-23b mimic NC;突变型实验组,mut-Speedy A-3'UTR质粒+miR-23b mimic;突变型对照组:mut-Speedy A-3'UTR质粒+miR-23b mimic NC,双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性. 结果 通过生物信息学方法结合本实验室前期建立的精原细胞和精母细胞小RNA数据库筛选出4个评分较高的miRNA:miR-23b、miR-143、miR-345-3p和miR-881.实时荧光定量PCR检测不同发育时期小鼠睾丸中以上4种miRNAs和Speedy A基因的表达水平,结果显示在不同发育时期的小鼠睾丸中,miR-23b的表达趋势与Speedy A呈显著负相关(P＜0.01).成功构建了重组野生型/突变型(WT/mut) Speedy A3’-UTR载体,通过双荧光素酶报告基因检测显示野生型实验组相比对照组吸光值明显降低,差异有统计学意义(P＜0.01). 结论 野生型实验组对其它3组对照组荧光活性有明显的抑制作用,证实miR-23b能够靶向调控Speedy A基因的表达.
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毒热平注射液对甲型流感病毒H3N2体外感染细胞中TLR7信号通路的影响
目的:观察甲型流感病毒H3N2感染人胚肾上皮细胞(HEK-293T)细胞及人肺腺癌上皮细胞(A549)细胞后,对NF-κB转录活性以及TLR7、TNF-α、IL-8、IFN-β mRNA的影响,探讨H3N2对体外感染细胞中TLR7信号通路的影响及清热解毒中药毒热平注射液的干预作用.方法:采用MTT法体外检测各组药物对293T、A549细胞增殖的影响;H3N2感染293T细胞后,利用双荧光素酶报告系统,以利巴韦林、清开灵注射液为药物对照,检测毒热平注射液各浓度组细胞中NF-κB相对荧光素酶活性;H3N2感染A549细胞后,RT-PCR方法检测各组细胞中TLR7、TNF-α、IL-8、IFN-β mRNA水平.结果:MTT结果显示,毒热平、利巴韦林、清开灵注射液各浓度不影响细胞正常增殖(P＞0.05).报告基因结果显示,与细胞对照组相比,H3N2感染组细胞NF-κB转录活性显著增高(P＜0.01);与H3N2感染组相比,利巴韦林0.5μg/mL,清开灵1/128稀释组,毒热平1μg/mL,10μg/mL,100μg/mL组均可不同程度下调NF-κB的转录活性(P＜0.01).RT-PCR结果显示,与细胞对照组比较,H3N2病毒组的TLR7、TNF-α、IL-8、IFN-β mRNA表达明显增高(P＜0.01);与H3N2感染组相比,一定浓度的药物组TLR7、TNF-α、IL-8、IFN-β mRNA表达量明显降低(P＜0.05或P＜0.01).结论:流感病毒H3N2攻击细胞可以显著上调TLR7受体的表达和核因子NF-κB转录活性,并引起下游相关靶基因的表达增多.毒热平注射液可以下调H3N2引起的TLR7信号通路的激活,抑制NF-κB的转录活性,减少下游炎性因子TNF-α、IL-8、IFN-β的表达.
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HIPK3基因3′UTR双荧光素酶报告质粒的构建及其与靶向miR-146的验证
目的 构建 HIPK3基因3′非编码区(3′UTR)双荧光素酶报告质粒,分析 miR-146对HIPK3的调控作用.方法 通过miRDB 数据库和DIANA TOOLS数据库预测miR-146与HIPK3基因的结合位点.将HIPK3基因的3′UTR序列以及其突变体插入至荧光素酶报告质粒psiCHECK-2,构建野生型(HIPK3-WT)及突变型HIPK3-MU)重组双荧光素酶报告质粒.将培养的293T 细胞分为6组,1)HIPK3-WT+NC 阴性对照;2)HIPK3-WT+miR-146a mimics;3)HIPK3-WT+miR-146b mimics;4)HIPK3-MU+NC阴性对照;5)HIPK3-MU+miR-146a mimics;6)HIPK3-MU+miR-146b mimics,48 h后检测6组细胞中荧光素酶活性.结果 成功构建了HIPK3-WT及HIPK3-MU重组双荧光素酶报告质粒;HIPK3-WT和miR-146b mimics共转染293T细胞后,荧光素酶活性降低(P<0.05).结论 miR-146a 与HIPK3基因不存在靶向关系,miR-146b可以调控HIPK3基因3′UTR.
关键词： miR-146 同源性的蛋白质激酶3 双荧光素酶报告系统 -
Cyclin H基因启动子区-1 SNP对转录活性的影响
目的 探讨CCNH基因启动子区-1SNP位点碱基变异对CCNH基因转录活性的影响.方法 通过PCR和定点突变技术,构建了含CCNH基因基础启动子及-1G突变启动子,用双荧光素酶报告系统观察此SNP对CCNH基因启动子转录活性的影响.结果 在AD293细胞中,-1G突变启动子活性比CCNH基础启动子活性低26%(P<0.05).结论 -1T→G碱基变异可显著降低CCNH基因启动子转录活性.
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p53激活抗肿瘤药物应用p21途径双荧光素酶报告系统筛选初步研究
目的:构建含人p21启动子的双荧光素酶报告载体,感染肿瘤细胞后用于检测p53激活的抗肿瘤药物筛选.方法:从人血白细胞DNA中克隆p21启动子,用于控制Firefly荧光素酶的表达;Renilla荧光素酶基因和EGFP基因与IRES相连,在CMV启动子控制下表达;将上述元件和基因克隆至载体pLL3.7中,应用酶切和测序反应验证后再转染至U251和Eca109肿瘤细胞建立细胞检测模型.结果:成功构建含人p21启动子、大小约13 kb的pLL3.7-Dluc重组质粒,经LipofecttamineTM转染后用于细胞药物筛选;采用MTT方法对8种不同药物对U251和Eca109细胞处理后进行IC50检测,其中姜黄素和丹参酮ⅡA在U251肿瘤细胞中的IC50分别为20和8μg/mL,Eca109细胞的IC50分别为12和25 μg/mL;药物作用转染后U251细胞48 h后作荧光素酶检测,计算F/R值并SPSS 13.0分析,姜黄素和丹参酮ⅡA的P值分别为0.003和0.024,药物作用后荧光检测结果显著;该实验在Eca109细胞模型中姜黄素和丹参酮ⅡA取得了一致性的结果,P值分别为0.001和0.015.人参皂苷Rb1与阴性对照组相比差异有统计学意义,P=0.022.结论:通过p21途径检测双荧光素酶基因的表达状况,提示姜黄素、丹参酮ⅡA和人参皂苷Rb1三种药物在U251和Eca109肿瘤细胞中具有使p53活性增加的功能.
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单纯疱疹性角膜炎免疫调节因子 IL-12 A与 microRNA-21靶向作用关系的实验研究
目的：寻找一种可同时调控白细胞介素-12A（IL-12A）等多个单纯疱疹性角膜炎（HSK）免疫调节因子的microRNA（miRNA）。鉴定miRNA与IL-12A等免疫调节因子的靶向调控作用并预测其在HSK中可能的作用机制。方法选取293T人胚肾细胞等培养材料进行实验。实验主要包括运用TargetScan v7．1、miRanda v2010、miRBase v2014及miRTarBase v6．0数据库进行多个免疫调节因子的miRNA预测，寻找共同的miRNA；运用miRBase数据库对各物种miR-21序列进行对比；通过RGator v3．0数据库分析hsa-miR-21在各组织中的表达情况；通过数据库检索，找出尚未验证的hsa-miR-21候选靶基因进行结合位点验证；通过构建IL-12A的3′-非翻译区（ UTR）野生型及突变型载体质粒，将相应的质粒与hsa-miR-21模拟物转染到293T细胞中；通过双荧光素酶报告系统检测萤光素酶活性，初步验证两者的靶向结合作用；运用以上数据库进行hsa-miR-21的候选靶基因预测，得出候选靶基因集合；对候选靶基因集合进行基因功能富集分析和信号转导通路富集分析，并预测hsa-miR-21在HSK中可能的作用机制。结果通过以上数据库检索，发现hsa-miR-21是可以同时调控以上多个HSK免疫调节因子的miRNA，且各物种miR-21的序列基本一致。研究发现IL-12A是尚未验证的候选靶基因。双荧光素酶报告系统分析表明hsa-miR-21能够靶向作用于IL-12A的3′-UTR （t＝－24．43，P＜0．05），初步证明两者有靶向结合作用。结合数据库筛选出hsa-miR-21的候选靶基因共609个，其基因功能主要富集于调节细胞、细胞蛋白质代谢等过程（ P＜0．05），并涉及到丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号转导通路、单纯疱疹感染通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、NF-κB信号通路及多种癌症通路（ P＜0．05）。研究结果表明，hsa-miR-21可能通过MAPK信号转导通路中的27个靶基因、单纯疱疹感染通路中的19个靶基因、TNF信号通路中的15个靶基因及NF-κB信号通路中的10个靶基因来调控HSK的发生和发展。结论 HSK免疫调节因子IL-12A等多个靶基因可同时被hsa-miR-21调节。 hsa-miR-21的靶基因参与多个生物学过程，与癌症和免疫炎症密切相关，其中MAPK信号转导通路、单纯疱疹感染通路、TNF信号通路及NF-κB信号通路可能是其参与HSK免疫调节中主要的作用机制。
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艾迪注射液对氯化钴诱导的Hela细胞缺氧诱导因子-1蛋白稳定及转录活性的影响研究
目的 研究抗癌中药复方艾迪注射液对缺氧诱导因子-1(HIF-1)蛋白稳定性及转录活性的影响.方法 MTT法检测艾迪注射液对Hela细胞增殖的影响.构建缺氧诱导因子-1的荧光素酶报告基因Hypoxia-responsive element-lueiferase reportor gene(HRE-LUC)利用双荧光素酶顺式报告系统,氯化钴模拟化学缺氧条件,检测不同浓度艾迪注射液对HRE-LUC相对荧光素酶值的影响.Western blot在蛋白质水平进一步验证在此条件下艾迪注射液对HIF-1α亚基蛋白稳定性的影响,RT-PCR进一步验证在此条件下艾迪注射液对HIF-1下游靶基因腺苷酸激酶3(AK3)转录水平的影响.结果 艾迪注射液对Hela细胞增殖有明显的抑制作用.艾迪注射液200、300、400 mL/L培养基组特异性地抑制缺氧条件下Hela细胞HRE-LUC相对荧光素酶值(P<0.05),且抑制作用随剂量增加而增强;Western blot显示艾迪注射液抑制氯化钴诱导的HIF-1α蛋白聚集,且抑制作用随剂量增加而增强;RT-PCR证实不同剂量的艾迪注射液均有抑制AK3基因转录的作用.结论 艾迪注射液对Hela细胞的增殖具有明显的抑制作用,其抗癌机制可能与抑制HIF-1α亚基蛋白稳定性及降低其转录活性有关.
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人参皂苷Rg1对H_2O_2诱导的293T细胞NF-κB转录活性影响
目的:观察人参皂苷Rg1对H_2O_2诱导HEK293T细胞损伤过程中NF-κB转录活性的影响,探讨人参皂苷Rg1的抗氧化机制.方法:H_2O_2模拟氧化应激条件,MTT法和台盼蓝染色法检测人参皂苷Rg1对细胞生长的影响;以DCFH-DA为探针流式细胞仪检测细胞内ROS水平;利用双荧光素酶顺式报告系统,检测人参皂苷Rg1对荧光素酶报告基因NF-κB-Luc相对荧光素酶值的影响,以检测人参皂苷Rg1是否具有下调H_2O_2诱导的NF-κB转录激活的作用.结果:H_2O_2诱导损伤的293T细胞存活率随H_2O_2浓度的增高而下降,相同H_2O_2浓度下,人参皂苷Rg1预保护组细胞存活率较损伤组显著提高(P＜0.05);H_2O_2处理后细胞内自由基明显增加,其荧光强度增加了40%～50%,而给予有效浓度的人参皂苷Rg1后,荧光强度降低35%～40%;与正常对照组比较,H_2O_2模拟氧化应激条件下,HEK293T细胞中NF-κB荧光素酶报告活性明显升高(P＜0.05),而在人参皂苷Rg1预保护组则明显受到抑制(P＜0.05).结论:人参皂苷Rg1对H_2O_2所致的细胞氧化应激损伤具有明显的保护作用,其可能机制是有效地清除了细胞内过多的自由基,下调了转录因子NF-κB的转录活性,继而抑制了NF-κB通路的激活.
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miR-570对胃癌细胞B7-H1蛋白表达的抑制作用
B7-H1是一种重要的负性共刺激分子,在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用,而微小RNA具有直接的转录后调控作用.本文研究miR-570对B7-H1表达的调控作用.首先将miR-570及其抑制剂anti-miR-570分别转染B7-H1表达阳性的人胃癌细胞SGC-7901和B7-H1表达阴性的人乳腺癌细胞MDA-MB-435,以流式细胞术检测B7-H1分子表达情况；然后构建pcDNA/B7-H1表达质粒与miR-570共转染CHO细胞,以流式细胞术检测CHO细胞上B7-H1分子的表达情况；后分别构建含B7-H1基因3'-UTR片段和含miR-570作用靶点序列的荧光素酶表达载体与miR-570共转染CHO细胞,用双荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性.结果显示miR-570能显著抑制SGC-7901细胞和B7-H1基因转染细胞膜上B7-H1蛋白的表达,并能显著抑制荧光素酶表达载体表达的荧光素酶蛋白,而且anti-miR-570能上调MDA-MB-435细胞上B7-H1表达.本研究证明miR-570能显著抑制B7-H1蛋白表达,为通过抑制B7-H1信号通路以增强机体抗肿瘤免疫力的治疗途径奠定了基础.
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人类精子VDAC2基因启动子在小鼠GC-2spd细胞的克隆和报告基因载体构建
目的 线粒体电压依赖性阴离子通道蛋白2 (Voltage-dependent anion channel 2,VDAC2)是VDAC重要的家族成员,参与机体众多的生理活动和病理疾病的发生发展.本次研究目的 主要是确定和验证人VDA C2基因启动子的活性,为进一步探究它的调控机制奠定基础.方法 通过从正常人射出的精子中提取基因组DNA.利用软件预测启动子区,我们针对性设计三对引物并正确的扩增出来.将验证正确的启动子序列结合到质粒PDSpsiCHECK-2中,转染到小鼠GC-2细胞中去.转染48h后,通过双荧光素酶报告基因系统检测预测片段的启动子活性.结果 VADC2基因上游-2000～+1000bp具有相对较高的活性.结论 这是首次对人类精子中VDA C2基因启动子的确定和活性验证,为后续研究VDAC2基因在精子的发生发展以及弱精子症方面提供新的研究思路.
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腺病毒介导的双荧光素酶报告系统的构建及其应用
目的:构建腺病毒介导的双荧光素酶报告系统,并利用其筛选一种广谱高活性启动子.方法:将待检测启动子控制的萤火虫荧光素酶(Fluc)基因表达框插入腺病毒E1区,CMV启动子控制的海肾荧光素酶(Rluc)基因表达框插入E3区作为内参,构建腺病毒介导的双荧光素酶报告系统.检测不同病毒感染量条件下测得的启动子活性数据差异、组内差异,难转染细胞内的转染情况,分析该系统的操作简便性、稳定可靠性.应用该系统检测常用启动子CAG、CASI及新启动子CCAU在一系列细胞内的活性,从中筛选出一种广谱高活性启动子.结果:成功构建了腺病毒介导的双荧光素酶报告系统;不同MOI值下测得的各启动子相对活性值无显著差异(P＞0.05);在所实验的细胞内均能有效且准确地测定各启动子的活性,且复孔间方差小;CCAU在所实验的9株细胞中的表达活性显著(P＜0.05)或极显著地(P＜0.01)高于CASI以及CAG的表达活性.结论:构建获得的腺病毒介导双荧光素酶报告系统操作简便、稳定可靠、通用性强,可作为启动子活性筛选的一种新方法;利用该系统筛选获得了一种新的广谱高活性启动子CCAU.
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CLPTM1L与miR-494靶向关系的双荧光素酶报告实验验证
目的:确定miR-494与CLPTM1L的靶向关系.方法:采用生物信息学方法预测miR-494与CLPTM1L基因的结合位点.采用PCR技术扩增CLPTM1L基因3'UTR片段,并克隆至pmirGLO载体,构建野生型及突变型重组双荧光素酶报告质粒.将培养的293T细胞分为4组,分别共转染miR-494或阴性对照和pmirGLO-CLPTM1L-W 3'UTR或pmirGLO-CLPTM1L-M 3'UTR,检测4组细胞中荧光素酶活性.结果:酶切和测序证实成功构建了野生型及突变型重组双荧光素酶报告质粒pmirGLO-CLPTM1 L-W 3'UTR和pmirGLO-CLPTM1L-M 3'UTR;与共转染miR-494 mimics和突变型CLPTM1L3'UTR质粒的293T细胞中荧光素酶活性(1.056 4±0.163 4)、共转染阴性对照序列和突变质粒的293T细胞中荧光素酶活性(0.961 3±0.177 9)或野生型质粒的293T细胞中荧光素酶活性(0.983 4±0.001 2)相比,共转染miR-494 mimics和野生型CLPTM1L 3'UTR质粒的293T细胞中荧光素酶活性(0.651 6±0.136 4)明显降低(F =4.476,P=0.040),其他3组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论:CLPTM1L与miR-494存在靶向关系.
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双荧光素酶报告系统鉴定hsa-miR-4443对TIMP2基因的调控作用
目的 通过构建组织基质金属蛋白酶抑制剂-2(tissue inhibitor of metalloproteinase-2 ,TIMP2)荧光素酶报告基因载体,观察hsa-miR-4443对TIMP2的靶向调控作用.方法 生物信息学软件预测hsa-miR-4443与TIMP23′端非翻译区(3′untranslated region ,3′UTR)的结合位点,设计合成包含hsa-miR-4443结合序列及突变序列的 TIMP2基因片段,构建野生型和突变型双荧光素酶报告基因载体,分别与hsa-miR-4443模拟物和阴性对照序列共转染MDA-MB-231细胞,检测荧光素酶活性,观察hsa-miR-4443对TIMP2表达的影响.结果 生物信息学分析显示在 TIMP23′UTR有3个hsa-miR-4443的潜在结合位点,酶切和测序结果均提示3个结合位点的野生型和突变型荧光素酶报告载体构建成功. hsa-miR-4443可通过第1个结合位点抑制野生型TIMP2载体的荧光素酶的表达,而对突变型载体的荧光素酶表达无影响(P＝0.002).结论 hsa-miR-4443可以靶向调控TIMP2的表达.
关键词： hsa-miR-4443 TIMP2 双荧光素酶报告系统 -
华蟾素注射液对HepG2细胞NF-κB通路的影响
目的 探讨华蟾素注射液对肝癌细胞株HepG2 NF-κB通路的影响.方法 在TNF-α激活NF-κB通路的条件下利用双荧光素酶报告基因系统检测华蟾素注射液对含有NF-κB反应元件的萤火虫荧光素酶报告基因pNF-κB-TA-luc转录活性的影响.Western blotting进一步验证华蟾素注射液对HepG2细胞核内NF-κB亚基p65蛋白量的影响,同时半定量RT-PCR检测NF-κB下游靶基因细胞间黏附分子1(ICAM-1)的转录水平.结果 0.25、0.5 μg/ml浓度的华蟾素注射液可有效地抑制pNF-κB-TA-luc报告基因的相对荧光素酶值(P<0.05).Western blot结果进一步证明华蟾素可使NF-κB亚基p65蛋白量降低,RT-PCR结果表明NF-κB下游靶基因ICAM-1表达降低.结论 华蟾素注射液的抗癌机制可能与抑制癌细胞NF-κB通路的活化有关.
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双荧光素酶报告基因检测斑马鱼c-Myb与lect2l的靶标关系
目的:构建斑马鱼lect2l基因启动子双荧光报告基因系统,研究lect2l是否是受c-Myb蛋白特异性调控的靶基因.方法:采用PCR方法克隆斑马鱼lect2l基因启动子序列,构建重组荧光素酶报告基因载体pGL4.20-lect2lp,并采用阳离子脂质体法将其与c-myb表达载体及pRL-CMV内参质粒共转染293T细胞,使用化学发光仪检测荧光强度并计算比值.结果:电泳显示酶切条带符合斑马鱼lect2l基因启动子序列长度,构建的重组荧光素酶报告基因质粒pGL4.20-lect2lp荧光素酶活性的表达是对照组的30.34倍.结论:斑马鱼lect2l基因启动子驱动的荧光素酶表达载体pGL4.20-lect2lp构建成功,双荧光素酶报告基因系统提示斑马鱼c-Myb蛋白对lect2-基因有转录激活作用.
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miRNA靶向调控CCR7抑制结肠癌细胞增殖及侵袭的研究
目的 探讨miRNA在调控趋化因子受体CCR7表达及对结肠癌细胞增殖及侵袭的影响.方法 利用生物信息学网站Target Scan、Pictar和miRanda,综合文献寻找与CCR7基因相互作用的miRNA,综合3个数据库和文献的结果选取5条miRNA分别为miR-let7、miR-21、miR-98、miR-145、miR-642研究.使用PCR方法扩增含CCR7基因3’-UTR区序列插入到双酶切的双荧光素酶报告载体中,使用lipofectamine2000转染试剂将报告载体和待筛选miRNA共转染293细胞,双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性.用迁移和transwell小室实验检测所预测的miRNA对结肠癌HCT116细胞转移和侵袭能力的影响.用Western blotting检测miRNA作用于结肠癌HCT116细胞后对CCR7蛋白表达的调控.结果 得到含CCR7基因3’-UTR序列的双荧光素酶报告重组质粒,并用凝胶电泳和基因测序的方法验证.CCR7基因3’-UTR上有miRNA的调控作用靶点;双荧光素酶报告显示miR-let7、miR-21组比空白对照组CCR7基因3’-UTR双荧光素酶基因报告载体的荧光素酶活性下降.miR-let7、miR-21能显著抑制结肠癌HCT116细胞迁移和侵袭能力,并且下调CCR7蛋白在HCT116细胞中的表达.结论 CCR7基因3’-UTR段双荧光素酶基因报告载体构建成功,miRNA(miR-let7和miR-21)对CCR7有负调控作用.miR-let7和miR-21能抑制CCR7蛋白的表达,并抑制结肠癌细胞转移和侵袭能力.
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人NaDC1基因启动子序列转录调控元件的初步分析
目的 对hNaDC1基因启动子序列转录调控元件进行初步分析.方法 构建hNaDC1基因5'侧翼序列系列缺失质粒,以双荧光素酶报告基因检测系统检测hNaDC1基因5'侧翼区(-2 232/+136)的转录调控元件与转录调控蛋白之间的相互作用.结果 pGL3-hNaDC1A质粒的转录活性高,为(2.98±0.45);pGL3-hNaDC1D的转录活性低,为(0.45±0.14).以pGL3-hNaDC1A质粒的转录活性为基准(100%),其他4种质粒相应的转录活性分别为:pGL3-hNaDC1B 86.7%,pGL3-hNaDC1C 89.4%,pGL3-hNaDC1D 15.8%,pGL3-hNaDC1E 61.2%.MatInspector 5.0软件预测结果显示hNaDC1基因5'侧翼启动子序列共含有22个14种转录因子结合位点.结论 hNaDC1基因5'侧翼区-1 084/-254和-12/+136区域可能存在有正性作用转录因子的结合位点.
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活化T细胞核因子对组成性启动子SV40的调控作用
目的:利用双荧光素酶报告系统探讨活化T细胞核因子(NFAT)能否调控常见组成性启动子CMV,SV40和TK,为不同条件下选择合适双荧光报告系统内参提供依据.方法:用限制性内切酶BglⅡ和HindⅢ分别从质粒pCDNA3.1和pRL-TK中切下CMV和TK启动子,克隆至pGL3-basic载体中,构建成pCMV-Luc和pTK-Luc载体.将构建pCMV-Luc和pTK-Luc以及商品化的pGL3-control(SV40启动子驱动),分别与SV40 (pBIND)和TK(pRL-TK)两种启动子驱动的两种内参质粒共转染入HEK293细胞；观察过表达组成性活化NFAT后相对荧光素酶活性读数的改变.结果:成功构建了pCMV-Luc和pTK-Luc质粒,荧光素酶活性检测发现,常见组成性启动子SV40启动子对过表达组成性活化的NFAT存在一定的反应.结论:T细胞活化过程中重要的转录因子NFAT能够调控SV40启动子活性；表明常见组成性启动子SV40并非真正、绝对的组成性不变.因此,在荧光素酶报告系统内参选择时需要充分考虑该问题,本研究为合理选择内参质粒提供了一个可行策略.
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环氧合酶2mRNA3'UTR荧光素酶报告基因载体的构建
目的:通过构建环氧合酶2( COX2)mRNA 3'UTR的全长及其截短体荧光素酶报告基因载体,为研究COX2基因在炎症条件下的的转录后调控提供有效的工具.方法:通过从胃癌细胞SGC-7901提取RNA,反转录成cDNA后,以此为模板,PCR扩增COX23’非翻译区(3’-UTR)全长及截短的序列,并将该序列连接到荧光素酶报告基因载体pGL3-control,构建pGL3-COX2 3'UTR全长及pGL3 -COX23' UTR不同截短体.测序后将上述载体分别与pRL-TK载体共转染293-T细胞,48 h后裂解细胞检测荧光素酶的活性.后通过ELISA检测在IL-1β的刺激下COX2的下游产物PGE2的表达,并再次测定pGL3-COX2 3' UTR全长的荧光素酶活性.结果:成功构建了pGL3-COX2 3'UTR全长及pGL3 -COX23’UTR不同截短体,荧光素酶报告系统表明COX2 3 'UTR对基因表达具有较强的调控作用.而在炎症因子IL-1β的刺激下,pGL3-COX2 3'UTR全长荧光素酶的活性明显升高.结论:成功构建了COX2 mRNA 3’UTR荧光素酶报告基因载体并证明在IL-13的刺激下COX2表达上调,参与转录后调控.
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TGF-β1调控基质金属蛋白酶-20(MMP-20)启动子转录活性的研究
目的:克隆MMP-20基因启动子序列,分析转化生长因子-β1对其转录活性的影响.方法:检索并分析MMP-20基因翻译起始点上游序列.利用PCR从小鼠基因组上扩增长度为2852 bp的启动子序列,并与pMD18-T克隆载体连接.经酶切反应初步鉴定后,以pMD18-T-MMP-20为模板,利用PCR方法获得带酶切位点的MMP-20启动子片段(2842 bp),并与pGL3-Basic载体连接.pGL3-MMP-20瞬时转染小鼠成釉细胞系(ALC)过夜后,在培养基中加入1 ng/mL TGF-B1,12 h后检测荧光素酶的活性.结果:经酶切反应和测序结果证实MMP-20启动子成功插入pGL3-Basic质粒.与pGL3-Basic质粒转染相比较,转染pGL3-MMP-20后荧光素酶活性明显增强;培养基中加入TGF-β1能促使pGL3-MMP-20荧光素酶活性进一步增强.结论:外源性MMP-20启动子在成釉细胞中被激活;TGF-β1能增强pGL3-MMP-20荧光素酶活性,提示釉质发育过程中,TGF-β1具有调节MMP-20基因表达的生物学功能.
关键词： 转化生长因子-β1 基质金属蛋白酶-20 启动子 双荧光素酶报告系统
