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Speedy A蛋白调控相关miRNA的筛选及miR-23b靶标的验证
目的 筛选和鉴定调控Speedy A蛋白表达的miRNAs. 方法 通过在线数据库TargetScan、miRNA和miR-walk预测与Speedy A相互作用的miRNAs,并结合本实验室前期建立的精原细胞和精母细胞小RNA数据库,筛选出评分较高的候选miRNAs.实时定量PCR检测小鼠7、14、21、35、64 d睾丸中候选miRNAs和Speedy A基因的表达,筛选出表达趋势呈显著负相关的miRNAs.构建野生型Speedy A基因3’端非翻译区荧光素酶报告基因载体(WT-Speedy A-3,UTR)及miR-23b靶序列突变型载体(mut-Speedy A-3'UTR),分四组转染HEK-293T细胞株:野生型实验组,WT-Speedy A-3,UTR质粒+miR-23b mimic;野生型对照组,WT-Speedy A-3'UTR质粒+miR-23b mimic NC;突变型实验组,mut-Speedy A-3'UTR质粒+miR-23b mimic;突变型对照组:mut-Speedy A-3'UTR质粒+miR-23b mimic NC,双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性. 结果 通过生物信息学方法结合本实验室前期建立的精原细胞和精母细胞小RNA数据库筛选出4个评分较高的miRNA:miR-23b、miR-143、miR-345-3p和miR-881.实时荧光定量PCR检测不同发育时期小鼠睾丸中以上4种miRNAs和Speedy A基因的表达水平,结果显示在不同发育时期的小鼠睾丸中,miR-23b的表达趋势与Speedy A呈显著负相关(P＜0.01).成功构建了重组野生型/突变型(WT/mut) Speedy A3’-UTR载体,通过双荧光素酶报告基因检测显示野生型实验组相比对照组吸光值明显降低,差异有统计学意义(P＜0.01). 结论 野生型实验组对其它3组对照组荧光活性有明显的抑制作用,证实miR-23b能够靶向调控Speedy A基因的表达.
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miR-23b在NSCLC患者血清中的表达及其预后评估价值分析
目的 观察miR-23b在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者血清中的表达水平及其对预后的评估价值.方法 选取我院2012年1月—2014年12月收治的86例NSCLC作为观察组,另选取同期于我院体检身体健康者60例作为对照组,分析两组血清miR-23 b表达情况及观察组患者随访3年后的生存情况,并分析影响NSCLC患者预后的相关因素.结果 ①观察组患者血清miR-23 b水平显著高于对照组,且观察组患者血清miR-23 b高表达率为74.42％显著高于对照组的20.00％,差异均有统计学意义(P<0.01);②miR-23 b高表达患者生存率明显低于miR-23 b低表达患者,差异有统计学意义(χ2=7.184,P=0.007);③病理分期过高、肿瘤存在远处转移、肿瘤存在淋巴结转移、肿瘤组织分化程度较低和miR-23 b高表达为NSCLC患者预后的独立危险因素.结论 miR-23 b在NSCLC患者血清中表达升高,且病理分期过高、肿瘤存在远处转移、肿瘤存在淋巴结转移、肿瘤组织分化程度较低和miR-23 b高表达为NSCLC患者预后的独立危险因素,血清miR-23 b可作为临床评估NSCLC患者预后的有效指标.
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miR-23b过表达对高糖诱导近端肾小管上皮细胞EMT及PI3K-AKT通路的影响
目的 研究过表达miR-23b对高糖诱导近端肾小管上皮细胞间充质转化(EMT)及PI3K-AKT通路的影响.方法 将人近端肾小管上皮细胞HK-2分为4组:正常葡萄糖(NG)组、高糖(HG)组、miR-23b阴性对照(NC)组和miR-23b过表达(mimic)组,转染48 h后,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-23bmRNA的表达,光学显微镜观察细胞形态,qRT-PCR检测波形蛋白(VIM)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏素(E-CD)mRNA的表达,蛋白免疫印迹(WB)检测VIM、α-SMA、E-CD、PI3K、Akt、p-Akt蛋白的表达.结果 与NG组比较,HG组中miR-23b表达显著下调,差异有统计学意义(P<0.05);转染miR-23b mimic后,HK-2细胞中miR-23b表达显著上调(P<0.05).与NG组比较,HG组、NC组和mimic组HK-2细胞出现大量纺锤形细胞,细胞中VIM、α-SMA mRNA和蛋白表达显著上调(P<0.05),E-CDmRNA和蛋白表达显著下调(P<0.05),PTEN蛋白表达上调(P<0.05),PI3K、p-Akt蛋白表达下调(P<0.05);与HG组、NC组比较,mimic组HK-2细胞纺锤形细胞数量明显减少,细胞中VIM、α-SMA mRNA和蛋白表达下调(P<0.05),E-CD、PI3K mRNA和蛋白表达上调(P<0.05),PTEN蛋白表达下调(P<0.05),PI3K、p-Akt蛋白表达上调(P<0.05).结论 过表达miR-23b抑制高糖诱导近端肾小管上皮细胞间充质转化作用,其机制可能与抑制PI3K-AKT通路激活有关.
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miR-23a/b在非小细胞肺癌的表达及临床意义
目的 研究miR-23a和miR-23b在非小细胞肺癌中的表达特征,并探讨其临床意义.方法 收集157例非小细胞肺癌手术切除标本及50例癌旁组织标本,采用Real time PCR方法检测miR-23a和miR-23b在非小细胞肺癌及其癌旁组织中的表达,分析二者表达的相关性,并探讨其表达与临床病理特征及其预后的关系.结果 miR-23a和miR-23b在非小细胞肺癌组织中的表达水平均高于癌旁肺组织,二者在非小细胞肺癌组织中表达呈正相关(r=0.351,P＜0.001).miR-23a和miR-23b联合高表达与淋巴结有无转移(P＜0.001)、远处转移(P=0.001)及临床分期(P=0.002)相关,而与年龄、性别、组织类型及组织分化程度无显著相关性(P＞0.05).Kaplan-Meier分析显示miR-23a和miR-23b联合高表达组患者生存期显著低于单独高表达组或联合低表达组(P=0.009),Cox风险比例模型分析显示miR-23a和miR-23b联合高表达为非小细胞肺癌患者的危险因素.结论 miR-23a和miR-23b在非小细胞肺癌中异常高表达可能是潜在的肺癌预后分子标志物.
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淫羊藿苷对激素诱导损伤骨微血管内皮细胞微小RNA表达的影响
背景：近年来研究证实微小RNA广泛参与调控人体发育、细胞增殖分化及凋亡、血管生成、脂质代谢等生理过程，同样微小RNA在股骨头坏死的病理过程中也具有重要的调控作用。作者所在实验室前期研究证实淫羊藿苷具有抑制激素诱导骨微血管内皮细胞凋亡的作用，并且可以显著提高骨微血管内皮细胞促血管生成蛋白粒细胞集落刺激因子的表达。但目前关于淫羊藿苷对骨微血管内皮细胞微小RNA的研究仍处于探索阶段，其具体作用靶点、可能的调节机制及信号通路尚不明确。
目的：探索淫羊藿苷对激素诱导人股骨头骨微血管内皮细胞微小RNA表达的影响及其可能的机制。
方法：采用作者所在实验室建立的方法分离、培养及鉴定人股骨头骨微血管内皮细胞，取第3代骨微血管内皮细胞，建立激素诱导损伤模型及淫羊藿苷预处理模型，采用微小RNA基因芯片对激素组和正常组进行差异性转录，运用实时定量PCR法对明显表达差异miR-339及miR-23b进行验证，同时探讨淫羊藿苷对miR-339及miR-23b表达的影响。
结果与结论：①对微小 RNA 基因芯片结果进行差异性分析，与正常组相比较，激素组中差异倍数﹥2的微小RNA共有5个，其中1个表达上调，4个表达下调；②实时定量PCR检测结果显示：与正常组相比，激素组中miR-339及miR-23b出现明显变化，与基因芯片结果一致。与激素组相比，淫羊藿苷预处理可以显著提高 miR-23b 的表达；③结果表明：淫羊藿苷可以有效预防激素诱导骨微血管内皮细胞损伤引起的miR-23b表达失衡，推测淫羊藿苷可能通过介导骨微血管内皮细胞miR-23b的表达参与激素性股骨头坏死病理过程的调控。 -
miR-23b通过调控ASK1抑制糖尿病肾病纤维化
目的:探讨miR-23b通过与靶基因ASK1作用对糖尿病肾病纤维化的影响.方法:通过建立动物模型(Ⅰ型糖尿病小鼠)和细胞模型(HK-2细胞),应用实时定量荧光PCR、免疫荧光、基因转染结合RT-PCR,检测ASK1、FN、miR-23b在糖尿病组(Dia组)和正常组(Con组)(P＜0.001)表达变化及在mRNA和蛋白水平上的作用关系.结果:miR-23b在Dia组的表达低于Con组;ASK1、FN在Dia组高表达,并且ASK1在Dia组中持续高表达;过表达miR-23b可以同时在mRNA和蛋白水平上抑制ASK1,P38的表达,FN表达也显著降低.结论:miR-23b可能通过作用靶基因ASK1及其信号通路抑制糖尿病肾病纤维化.
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槲皮素抑制宫颈癌Siha细胞增殖和侵袭实验研究
目的 探讨槲皮素对人宫颈癌Siha细胞生长、增殖、黏附、迁移和侵袭的影响.方法 对数生长期人宫颈癌Siha细胞,分为对照组和20、40、80 μmol/L槲皮素组,分别加入0、20、40、80 μmol/L槲皮素进行处理;采用MTT法检测各组细胞增殖率,采用划痕试验检测各组细胞迁移距离和迁移率,采用Transwell小室检测各组侵袭细胞数和侵袭抑制率,采用实时定量PCR反应检测对照组与80 μmol/L槲皮素组细胞HOTAIR、miR-23b、MAPK1 mRNA表达水平,采用Western blot法检测各组细胞HOTAIR、miR-23b、MAPK1蛋白表达水平.结果 对照组和20、40、80 μmol/L槲皮素组细胞增殖率、细胞迁移距离、迁移率、侵袭细胞数依次降低(P＜0.05),侵袭抑制率依次增高(P＜0.05);80 μmol/L槲皮素组细胞HOTAIR mRNA(0.723±0.089)、MAPK1 mRNA(0.786±0.166)表达水平低于对照组(1.665±0.104、1.637±0.151),miR-23b mRNA表达水平(6.671±0.093)高于对照组(1.578±0.112) (P＜0.05);对照组和20、40、80 μmol/L槲皮素组细胞HOTAIR蛋白(0.97±0.15、0.72±0.09、0.54±0.11、0.33±0.07)、MAPK1蛋白(0.74±0.07、0.42±0.08、0.21±0.05、0.13±0.03)表达水平依次降低,miR-23b蛋白表达水平(0.18±0.02、0.43±0.06、0.67±0.10、0.88±0.09)依次增高(P＜0.05).结论 槲皮素明显抑制Siha细胞生长、增殖、迁移和侵袭,其机制可能与其下调长链非编码RNA HOTAIR并通过其靶向调控miR-23b/MAPK1轴有关.
